薛太阳，曾娟 ，刘士嘉，田野

（中国医科大学附属盛京医院脊柱关节骨科，沈阳110004）

骨性关节炎（osteoarthritis , OA）是最常见的慢性关节疾病[1]，以关节软骨退变、滑膜增生、骨赘形成以及软骨下骨硬化为特征，临床上主要表现为关节疼痛、畸形、活动受限等症状，严重影响生活质量[2]。在所有的骨性关节炎中，膝关节骨性关节炎发生的几率最高[3]。虽然目前对于膝关节骨性关节炎发生的病理生理因素没有明确，但公认的是膝关节骨性关节炎的发病是多因素的。目前对于膝关节OA的治疗停留在早期通过应用非甾体抗炎药物、关节腔注射透明质酸等、减少运动量等方法来控制症状、延缓病情，晚期则建议进行手术治疗以改善患肢功能、提高生活质量、矫正畸形等[4,5]。由于膝关节OA发病率的增高以及该疾病的高致残疾率，使得对于OA病因及治疗的研究越来越受到重视。目前，对于OA的发病机制尚不明确，但是多数学者认为信号通路在OA疾病发生及进展中起关键作用。在OA的发生与进展过程中，存在多条信号通路的参与，包括Notch、 Wnt、OPG-RANK-RANKL、SDF-1/CXCR4及p38-MAPK等[6]，其中Notch信号通路已经被证实在软骨细胞增殖、分化的调控[7]、细胞外基质的形成[8]以及维持软骨基质代谢平衡等方面起着十分重要的作用。

本研究通过建立大鼠膝骨关节炎模型并对其中部分采用γ-分泌酶（γ-secretase）抑制剂(2S)-N-[N-(3,5-二氟苯乙酰基)-L-丙氨酰]-2-苯基甘氨酸叔 丁 酯{（2S)-N-[N-(3,5-Difluorophenacetyl)-L-alanyl]-2-phenylglycine tert-butyl ester，DAPT}[9]进行膝关节腔注射以抑制Notch信号通路[10]， HE染色观察骨关节炎关节软骨的组织病理学变化，利用免疫组织化学染色检测关节软骨内基质金属蛋白酶13（matrix metalloproteinases-13, MMP-13）、Ⅱ型胶原蛋白（ type Ⅱ collagen, Col Ⅱ）免疫反应性变化，以分析抑制Notch信号通路对骨关节炎进展的影响。

材料和方法

1 实验动物

6周龄雄性SD大鼠60只，体重180～200g，由本溪长生公司提供 [许可证号：SCXK（辽）2015.0001]。分笼适应性饲养2周（22℃，充足食水）后随机分为6周空白组、6周手术组、6周抑制组、8周空白组、8周手术组和8周抑制组。

2 主要试剂

兔抗鼠 MMP-13多克隆抗体（武汉博士德，BA2204），兔抗鼠Ⅱ型胶原蛋白多克隆抗体（武汉博士德，BA0533），DAPT（Selleckchem，S2215），10%中性福尔马林（Solarbio，G2161），EDTA脱钙液（Solarbio，E1171），HE显色试剂盒（Solarbio，G1120），抗原修复液I（武汉博士德，AR0026），免疫组织化学试剂盒（包含内源性过氧化物酶阻断剂，动物非免疫血清，生物素标记的羊抗鼠/兔IgG，链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶；迈新试剂，KIT-9720），DAB显色液（武汉博士德，AR1002）。

3 主要仪器及应用软件

组织包埋机（Leica EG1150H），石蜡切片机（Thermo Microm HM340E，切片机刀片Leica 819），全自动过缸染色机（Leica Autostainer XL），恒温箱（天津泰斯特 DH4000），显微镜（Nikon E800），图像采集软件 （NIS-Elements F3.0，Nikon），图像分析软件（NIS-Elements Br3.0，Nikon）。

4 膝骨关节炎动物模型建立与干预

将大鼠腹腔注射10%水合氯醛[11]进行麻醉，右后肢膝关节进行手术切断前交叉韧带，行前抽屉试验确定前交叉韧带完全切断，清理残端，股骨端切断内侧副韧带并摘除内侧半月板[12]，手术过程中注意保护关节软骨，生理盐水棉球止血，缝合，消毒。术后光照2h保持体温待大鼠苏醒后单独放置于笼中，允许正常活动，常规饲食水。于术后2周，大鼠右后肢着地可用力后，6周抑制组及8周抑制组大鼠右后肢膝关节腔注射DAPT（100ng/kg），6周手术组及8周手术组右后肢膝关节注射等体积生理盐水，每周两次。空白组不进行干预。

5 标本采集与石蜡包埋

术后6周和8周分别处死相应组别大鼠，截取右后肢膝关节股骨内侧髁，入10%中性福尔马林固定72h，PBS液冲洗，EDTA脱钙液浸泡1个月，其间1周更换一次脱钙液，脱钙后流水冲洗10min，顺序置入50%乙醇2h、75%乙醇2h、95%乙醇2h、无水乙醇I 2h、无水乙醇II 2h、二甲苯I 30min、二甲苯II 30min、65℃石蜡液I 1h、65℃石蜡液II 1h，石蜡包埋机包埋。

6 HE染色

包埋后的标本用切片机切4μm标本切片，捞片、烤片、65℃恒温箱过夜，脱蜡、脱苯、至水。滴加苏木素5min染色后甩去，滴加分化液30s，自来水返蓝10min，滴加伊红液2min，自来水冲洗10min。脱水、透明、中性树胶及盖玻片封片。

7 基质金属蛋白酶13（MMP-13）免疫组织化学实验

包埋后的标本以切片机切4μm标本切片，捞片、烤片、65℃恒温箱过夜，脱蜡、脱苯、至水。抗原修复液进行抗原修复（37℃，30min），PBS液冲洗3次，滴加内源性过氧化物酶阻断剂（室温30min），PBS液冲洗3次，滴加非免疫血清室温孵育30min，甩去，滴加 MMP-13（1∶150）或 ColⅡ（1∶20），4℃过夜，PBS液冲洗3次，滴加生物素标记的二抗（室温30min），PBS液冲洗3次，滴加链霉菌抗生物素蛋白-过氧化酶（室温30min），PBS冲洗3次，滴加DAB显色液至镜下开始显色，水洗，苏木素染色5min，流水返蓝10min。脱水、透明、中性树胶及盖玻片封片。以40倍物镜下拍照，通过图像分析软件NIS-Elements Br 3.0进行图像分析，以光密度值（optical density，OD）作为MMP-13或Col Ⅱ免疫反应性强弱指标。

8 统计学分析

采用GraphPad Prism 5.0统计软件进行统计学分析。全部数据以均数 ± 标准差表示，组间比较采用t检验，P ＜ 0.05为组间差异有统计学意义。

结 果

1 DAPT 抑制骨关节炎关节软骨组织学损害

HE染色检测显示（图1），正常（空白组）大鼠膝关节软骨面平整，四层软骨结构及潮线清晰，软骨细胞排列整齐；6周手术组膝关节软骨面不规则，有小裂纹及破溃，潮线识别度较差，四层软骨结构欠清晰，软骨细胞中度增生；6周抑制组膝关节软骨面略粗糙，可见裂纹及破溃，4层软骨结构可辨别，潮线可识别，软骨细胞轻度增生，排列尚可；8周手术组软骨面严重不规则，裂纹及破溃可达深层，潮线及四层软骨结构无法辨别，软骨细胞大量减少，出现局部增生，排列紊乱；8周抑制组软骨面不规则，有较大裂纹及破溃，潮线识别度差，4层软骨细胞结构不清晰，软骨细胞弥漫增生，细胞排列紊乱。8周手术组大鼠膝关节软骨破坏较6周手术组大鼠膝关节软骨破坏程度严重，6周抑制组大鼠膝关节软骨破坏较6周抑制组大鼠膝关节软骨破坏严重程度减轻，8周抑制组大鼠膝关节软骨破坏较8周手术组大鼠膝关节软骨破坏程度减轻。

2 DAPT抑制骨关节炎关节软骨内MMP-13免疫反应性增强

应用免疫组织化学检测对各组软骨内MMP-3免疫反应性进行比较显示（图2，图3）： 8周空白组与6周空白组比较无明显差异，8周手术组较6周手术组明显增强，6周手术组较6周空白组明显增强，8周手术组较8周空白组明显增强，6周抑制组和8周抑制组分别较6周手术组和8周手术组减弱，说明骨关节炎关节软骨中MMP-13免疫反应性与骨关节炎严重程度呈正相关，抑制Notch信号通路可显著抑制骨关节炎关节软骨中MMP-13免疫反应性的增强。

图3 DAPT处理对骨关节炎关节软骨内MMP-3免疫反应性影响的统计学分析。*，P＜0.01Fig. 3 Statistical analysis of the MMP-13 levels in articular cartilage of rat knee osteoarthritis among different treatment groups. *, P＜0.01

3 DAPT 抑制骨关节炎关节软骨内Ⅱ型胶原蛋白减少

应用免疫组织化学检测对各组软骨内Ⅱ型胶原蛋白免疫反应性进行比较显示（图4，图5）： 8周空白组与6周空白组比较无明显差异，8周手术组较6周手术组明显降低，6周手术组较6周空白组明显降低，8周手术组较8周空白组明显降低，6周抑制组和8周抑制组分别较6周手术组和8周手术组增强，说明骨关节炎关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白免疫反应性与骨关节炎严重程度呈负相关，抑制Notch信号通路可显著抑制骨关节炎关节软骨中Ⅱ型胶原蛋白免疫反应性的降低。

图5 DAPT处理对骨关节炎关节软骨内Col Ⅱ免疫反应性影响的统计学分析。*，P＜0.01Fig. 5 Statistical analysis of the Col II levels in the articular cartilage of rat knee osteoarthritis among different treatment groups. *, P＜0.01

图1 DAPT处理对骨关节炎关节软骨组织病理学影响的HE染色检测。比例尺，200μmFig. 1 The effect of DAPT on the histopathology of articular cartilage was evaluated by HE staining in rat knee osteoarthritis. Scale bar, 200μm

讨 论

与正常人相比，OA患者关节滑膜中Notch受体表达的类型差异明显[13]。Notch信号通路在OA软骨中特异性表达，通过对于基因转录的调控，使OA呈现出不同的表型[14]；VEGF信号通路以及Notch信号通路进行联合调控对PMSCs的软骨修复有协同作用[15]。可见Notch信号通路在软骨细胞分化调控方面起到的作用十分复杂[16]，其作用可能是双向的[17]。目前文献报道Notch信号通路作用的在体研究较少，本实验通过建立大鼠模型并使用DAPT进行大鼠膝关节腔注射来抑制Notch通路以探究Notch信号通路抑制后大鼠膝骨关节炎进展情况。

图2 DAPT处理对骨关节炎关节软骨内MMP-13水平影响的免疫组织化学检测。比例尺，200μmFig. 2 The effect of DAPT on MMP-13 level in the articular cartilage of rat knee osteoarthritis was assessed using immunohistochemistry. Scale bar,200μm

由于伦理原则等原因，对于骨关节炎及防治方法的在体研究主要依赖于动物OA模型。鼠类关节组织的结构以及在患OA时关节形态学方面、实验室指标等与人类患者较为相似[18]，所以多选用鼠类建立OA模型。本实验选用SD大鼠进行膝骨关节炎造模，选用了半改良Hulth法，即在改良Hulth法切断前交叉韧带并摘除内侧半月板的基础上，切断内侧副韧带，并保留了Hulth法切断的后交叉韧带[19]，使骨关节炎模型建立速度控制在需求范围内。

图4 DAPT处理对骨关节炎关节软骨内Ⅱ型胶原蛋白水平影响的免疫组织化学检测。比例尺，200μmFig. 4 The effect of DAPT treatment on Col Ⅱ level in the articular cartilage of rat knee osteoarthritis was evaluated by immunohistochemistry. Scale bar, 200μm

目前研究认为基质金属蛋白酶家族（MMPs），尤其是MMP-13在骨关节炎发展过程中起重要作用[20]。软骨细胞合成Ⅱ型胶原蛋白、蛋白多糖等并分泌到细胞外基质，形成纤维网架结构对软骨细胞进行保护。在骨关节炎发展过程中，MMP-13表达增加使得Ⅱ型胶原蛋白降解增多，Ⅱ型胶原蛋白降解与分泌失衡[21]，细胞外基质纤维网架结果遭到破坏，损伤软骨细胞。在骨关节炎软骨细胞中，MMP-13表达与骨关节炎严重程度呈正相关，而Ⅱ型胶原蛋白表达程度与骨关节炎严重程度呈负相关。本实验对各组软骨细胞MMP-13及Ⅱ型胶原蛋白表达情况进行分析表明，随着骨关节炎的发生发展，MMP-13的表达及Ⅱ型胶原蛋白破坏的增加得到了验证；抑制Notch信号通路后，MMP-13表达降低，Ⅱ型胶原蛋白破坏减少，骨关节炎减轻。由此可见，抑制Notch信号通路可能通过抑制骨关节炎关节软骨内MMP-13表达的上调而减少Ⅱ型胶原蛋白降解，从而减轻骨关节炎。