柱前衍生RP-HPLC法测定肽藻营养粉中游离氨基酸的含量

2018-08-19欧阳道福杨泽锐郁晓艺吴晓春

现代食品科技 2018年7期

欧阳道福，杨泽锐，郁晓艺，吴晓春

（完美（广东）日用品有限公司，完美（中国）有限公司，广东中山 528402）

肽藻营养粉由南瓜粉、大豆肽、薏苡仁粉、低聚果糖、乳清蛋白、螺旋藻、玉米粉、植脂末、麦芽、莲子粉、乙基麦芽酚、三氯蔗糖为原料，经混合、分装制成的具有增强免疫力功能的保健食品，其含有丰富的多肽类及游离氨基酸类成分。氨基酸是构成人体蛋白质的组成部分，也是机体合成抗体、激素、酶类以及其他组织的原料。而且作为一种人体可直接吸收的营养成分，它的含量和成分能够部分地反映出食品的营养价值，游离氨基酸不仅可以维护新陈代谢、生长、免疫，还可以呈现出酸、甜、苦、涩及鲜等味道，赋予了食品丰富的味觉层次[1]。然而对于肽藻营养粉中游离氨基酸的种类及其含量的研究目前并未见文献报道。

目前文献资料及国标中主要采用氨基酸分析仪法和高效液相色谱法[2～6]测定氨基酸的含量。氨基酸分析仪法具有操作简便，无需单独进行柱前衍生等优点，但在运用过程中-有硬件配置复杂、用途专一、灵活性差、购买及维护成本高、分析时间很长、破坏氨基酸的固有结构等缺点；近年来高效液相色谱已广泛用于氨基酸的测定，其无需特殊反应装置，具有高效、简便、快速、准确和价格低廉等优点，已成为检测氨基酸的首选方法。

本研究参考GB/T 22729-2008海洋鱼低聚肽粉[7]中游离氨基酸高效液相色谱仪测定法建立了柱前自动衍生化 RP-HPLC法同时测定肽藻营养粉多种游离氨基酸的方法，以期为肽藻营养粉及其同类产品中游离氨基酸种类的确定及其质量控制提供参考，同时确定肽藻营养粉中游离氨基酸的种类及其具体含量，为其增强免疫力保健功能的物质基础提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

游离氨基酸混合对照品（1 nmol/µL），（批号：BCBT8196）：美国安捷伦科技有限公司；完美餐牌肽藻营养粉（批号为 164227-1、164227-2、164227-3、164227-4、164227-5、164227-6）：完美（中国）有限公司；纯化水、超纯水：超纯水系统制备；三氯乙酸、冰醋酸、三水合乙酸钠、三乙胺、3-巯基丙酸、硼酸、四氢呋喃：分析纯，广州化学试剂厂；甲醇、乙腈：色谱纯，美国默克公司。

1.2 仪器与设备

Sartorius CPA225D电子天平：德国赛多利思公司；Agilent 1260高效液相色谱仪：美国安捷伦公司；Elma P180H型超声波清洗器：德国艾尔玛公司；AnkeLXJ-IIB离心机：上海安亭科学仪器厂；MILLI-Q超纯水系统：德国默克公司。

1.3 方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱为Agilent Hypersil ODS；柱温40 ℃；检测器为二极管阵列检测器，检测波长为 0～24 min为338 nm，24 min以后切换为262 nm；流动相A：醋酸钠-三乙胺缓冲液（pH 7.20±0.05），加入0.5%四氢呋喃调节峰型；流动相B：醋酸钠缓冲液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40），梯度洗脱，洗脱程序为 0～27 min，92%～40% A；27～31.5 min，40%～0% A；31.5～32 min，0% A；32～34 min，0%～100% A；34～35.5 min，100%～92% A；流速为1.0 mL/min。

1.3.2 溶液的配制

1.3.2.1 硼酸缓冲液的配制

称取2.44 g硼酸至100 mL烧杯中，加水溶解，加200 g/L氢氧化钠调节pH至10.2±0.1，转移至100 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3.2.2 OPA衍生剂的配制

称取100 mg OPA到10 mL容量瓶中，加1 mL乙腈，130 µL 3-巯基丙酸，以0.4 mol/L硼酸缓冲液定容至刻度，摇匀。

1.3.2.3 FOMC-Cl衍生剂的配制

称取50 mg FOMC-Cl到10 mL容量瓶中，用乙腈定容至刻度，摇匀。

1.3.2.4 对照品溶液的配制

取游离氨基酸混合对照品（1 nmol/µL）直接过0.45 µm水相滤膜，即得。1.3.2.5 供试品溶液的制备

精密称取肽藻营养粉样品1 g于25 mL容量瓶中，加入20 mL 5%三氯乙酸溶液，超声20 min，定容至25 mL，静置2 h，4000 r/min离心30 min，取上清液过0.45 µm水相滤膜，即为供试品溶液。

1.3.3 衍生方法

利用自动进样器进行在线自动衍生：衍生程序如表1所示：

表1 柱前衍生化步骤Table 1 The steps of precolumn derivatization

注：样品瓶1放置OPA衍生剂；样品瓶2放置FOMC-Cl衍生剂；样品瓶3放置水（瓶盖不加垫片）；样品瓶4放置0.4 mol/L硼酸。

2 结果与讨论

2.1 仪器条件的优化

2.1.1 流动相的选择

比较了以下两种流动相：流动相1：流动相A：醋酸钠-三乙胺缓冲液（pH 7.20±0.05），加入0.3%四氢呋喃调节峰型；流动相 B：醋酸钠缓冲液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40）（国标 GB/T 22729-2008中使用的流动相）；流动相2：流动相A：醋酸钠-三乙胺缓冲液（pH 7.20±0.05），加入0.5%四氢呋喃调节峰型；流动相 B：醋酸钠缓冲液（pH 7.20±0.05）-乙腈-甲醇（20∶40∶40）。

两种流动相条件均梯度洗脱，洗脱程序为 0～27 min，92%～40% A；27～31.5 min，40%～0% A；31.5～32 min，0% A；32～34 min，0%～100% A；34～35.5 min，100%～92% A；流速为1.0 mL/min；色谱柱为Agilent Hypersil ODS；柱温40 ℃；检测器为二极管阵列检测器，检测波长为0～24 min为338 nm，24 min以后切换为262 nm。

在此条件下，由图1可知，两种流动相条件下均能使17种氨基酸进行有效分离，但是流动相1中峰2的峰型较差，且各成分保留时间相对偏后，分析时间较长，因此选择流动相2作为最终流动相。

图1 不同流动相考察结果图Fig.1 HPLC chromatograms with different mobile phase

2.1.2 色谱柱的选择

图2 不同色谱柱考察结果图Fig.2 HPLC chromatograms with different type of column

本研究系统考察了三种不同型号（Agilent Hypersil ODS，5 μm，4.0×250 mm；Agilent Extend ODS，5 μm，4.6×250 mm；Waters Symmestry ODS，5 μm，4.6×250 mm）色谱柱的效果，结果如图2所示，Symmestry和Extend的柱子分离度和脯氨酸（17号峰）的峰型均不理想，综合分析Hypersil柱子的分离度和峰型均达到最佳状态。

2.1.3 柱温的选择

图3 不同柱温考察结果图Fig.3 Figures of HPLC chromatograms with different column temperature

温度的微小变化能引起流动相密度改变，进而改变对分析物的溶解能力，所以调节柱温可以调节目标化合物的分离效果。本研究考察了三种不同柱温条件下色谱的分离情况，结果如图3所示，35 ℃下13和14号峰分离度为1.37，45 ℃下3号峰出现裂峰，峰型不好，综合分析40 ℃条件下分离度和峰型均达到最佳状态，因此最终选择柱温为40 ℃。

2.1.4 衍生方式的选择

氨基酸极性较强，为提高其在反相液相色谱柱上的保留，常常需要将氨基酸进行柱前衍生。柱前自动衍生-HPLC法测定氨基酸的含量时，由于衍生试剂或衍生产物不稳定，导致手工操作很难保证衍生过程的快速、及时、均一。本方法采用带全自动衍生功能的自动进样器按预先设定的程序，以OPA和FOMC-Cl为衍生试剂进行在线衍生，衍生后直接进样分析，有效消除了离线衍生由于进样时间不同和手工操作速度慢、不均一造成的误差，不仅提高了准确性，而且简化了操作过程并降低了工作强度[8～10]。

2.1.5 色谱条件确认

根据“2.1.1～2.1.4”考察所得结果，精密吸取混合对照品溶液、空白溶剂试液以及供试品试液各1 µL，按照“1.3.3”项在线衍生处理后，以“1.3.1”项色谱条件进行分析，结果见图 4。结果表明，在此色谱条件下，各氨基酸成分可以有效分离，空白溶剂在与混合对照品溶液色谱图相同保留时间处不出现相同色谱峰，而供试品在与混合对照品溶液色谱图相同保留时间处出现相同色谱峰。说明该方法专属性性好，阴性无干扰。氨基酸 17个衍生物色谱峰的分离度及理论塔板数见表2。由表2可知，各氨基酸衍生物的分离度均大于1.5，理论塔板数均大于10000。（注：在空白溶剂色谱图上，与5号对照品相同位置处出现一个色谱峰，但其信噪比仅为6.1，低于定量限，故可忽略不计）。

图4 各溶液高效液相色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of different solutions

2.2 线性关系与定量限考察

分别将“1.3.2.4”项下的混合氨基酸标准品稀释为0.025、0.063、0.125、0.200、0.500、1.000 nmol/µL，在线衍生之后进行色谱分析，以各氨基酸的峰面积为纵坐标，相应的氨基酸含量为横坐标绘制工作曲线，并求出回归方程、线性相关系数以及线性范围，并以信噪比 S/N=10时的质量浓度作为定量限，测得各氨基酸的定量限。结果见表 3。结果表明，在下述浓度范围内，各氨基酸与各自峰面积呈良好的线性关系。

表2 氨基酸对照品各衍生物分离度及理论塔板数Table 2 Resolution and theoretical plate number for peaks of reference substances derivatives

表3 线性关系及定量限考察结果Table 3 The result of linearity and the limit of quantitation

2.3 精密度、重复性以及加样回收率实验

表4 精密度、重复性以加样回收率考察结果Table 4 The result of precision epeatability and recovery(n=6)

取“1.3.2.4”项下的混合氨基酸标准品，在线衍生之后进行色谱分析，连续进样6次，测定17种氨基酸衍生物进样精密度；精密称取样品（164227-1）6份，每份约1 g，按照“1.3.2.5”项下制备供试品溶液，在线衍生之后进行色谱分析，计算各种氨基酸含量及RSD，作为重复性实验结果；精密称取已知含量的样品（164227-1）6份，精密加入“1.3.2.4”项下的混合氨基酸标准品各1 mL，按照“1.3.2.5”项下制备供试品溶液，在线衍生之后进行色谱分析，计算回收率和RSD。结果见表4。结果表明，17种氨基酸的精密度均小于2%，说明仪器精密度良好；重复性实验中，除了异亮氨酸外（RSD值为10.20%），其余各种氨基酸的RSD均小于10%，结果表明该方法重复性好；各氨基酸回收率在 85%～115%之间（除胱氨酸略高外），RSD基本均小于5%。

2.4 样品含量测定

取6个批次肽藻营养粉样品各1 g，按“1.3.2（5）”项下的方法操作制备供试品溶液，每个样品平行2份，按照“1.3.3”项在线衍生处理后，以“1.3.1”项色谱条件进行分析，计算各供试品中17个游离氨基酸的含量以及总量，由测定结果（表 5）可知，样品中至少含有14种氨基酸，其中6种为人体必需氨基酸。氨基酸总量均在500 mg/100 g以上，亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、精氨酸、天门冬氨酸、谷氨酸的含量均达到 50 mg/100 g以上，可见该营养粉中的氨基酸资源非常丰富，为其增强免疫力保健功能的物质基础提供了数据支撑。