梁金玲，黄玉霞，何金兴

（齐鲁工业大学（山东省科学院）食品科学与工程学院，山东济南 250353）

四环素类抗生素是由链霉菌产生的含多环并四苯羧基酰胺母核的一类抗生素，常见的有四环素、土霉素、强力霉素和金霉素等[1]。四环素类抗生素不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和支原体有抑制作用，甚至对衣原体和立克次氏体的活性也有影响[2]，且价格低廉，广泛应用于动物养殖领域。为了预防动物疾病、促进生长和繁殖，这类抗生素经常被滥用，导致其在动物体内大量残留，经人食用后具有损害牙齿、骨骼、消化道和肝肾，甚至严重危及人体生命安全的潜在风险[3～6]。美国食品药品监督管理局规定肌肉中四环素残留总量不超过 0.2 mg/kg，牛奶中不超过 0.4 mg/kg[7]。欧盟和我国规定在动物肌肉组织和奶中的最大残留量为 100 μg/kg[8,9]。因此，建立方便有效的方法来检测动物源性食品中的四环素类抗生素具有重要意义。

目前，四环素类抗生素检测方法主要有微生物法[10]，高效液相色谱法[11]，免疫层析法[12]，毛细管电泳法[13]，液相色谱-质谱联用法[14]等。其中，高效液相色谱法是最常用的方法。但由于食品基质的复杂性，检测前必须进行复杂的样品前处理程序。固相萃取技术因操作简便、效率高，溶剂用量少等优点，克服了传统液-液萃取法的缺点，成为目前普遍应用的样品前处理方法。由于食品基质的干扰，如何获得高选择性的固相萃取材料是目前限制固相萃取样品前处理技术的关键。分子印迹技术是以抗原抗体原理为依托，制备对目标分子具有高选择性聚合物的方法，是目前研究的热点之一。

本文以盐酸四环素为模板，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，偶氮二异丁腈作为引发剂，合成了针对四环素类抗生素的分子印迹聚合物，并以此材料作为固相吸附材料，建立固相萃取技术对鸡肉样品中的四环素类抗生素进行提取、富集、净化，并与高效液相色谱联用检测鸡肉样品中四环素类抗生素残留。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

岛津LC-20AT高效液相色谱仪-SPD检测器，日本Shimadzu公司；固相萃取仪，Supelco USA；TU1901双光束紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限公司。

盐酸四环素（TC）、磺胺二甲基嘧啶（SMZ）、磺胺氯哒唑（SCP），Sigma公司；盐酸土霉素（OTC），Solarbio公司；盐酸强力霉素（DC），上海源叶生物科技有限公司；甲基丙烯酸（MAA），偶氮二异丁腈(AIBN)，分析纯，天津市科密欧化学化学试剂有限公司；乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)，分析纯，上海阿拉丁；甲醇、乙腈，色谱纯，上海麦克林生化科技有限公司；冰醋酸，分析纯，天津市富宇精细化工有限公司；一水合柠檬酸、无水磷酸氢二钠、乙二胺四乙酸二钠，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；水为超纯水，MAA和EGDMA在使用前需要减压蒸馏纯化，AIBN需用95%乙醇重结晶后使用。

标准溶液的配置：准确称取TC、OTC、DC标准品各10.0 mg，用甲醇定容至100 mL，配置成100 mg/L的混合溶液。其他标准溶液均由此稀释而来。

0.1 mol/L的柠檬酸溶液的配置：称取21.01 g柠檬酸，用水定容至1000 mL。

0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液的配置：称取71.63 g磷酸氢二钠，用水定容至1000 mL。

MclIvaine缓冲溶液的配制：将1000 mL 0.1 mol/L的柠檬酸溶液与625 mL 0.2 mol/L的磷酸氢二钠溶液混合，用1 mol/L的盐酸或NaOH调PH至4.0±0.05。

0.1 mol/L的Na2EDTA-MclIvaine缓冲溶液的配制：称取 60.50 g乙二胺四乙酸二钠放入 1625 mL MclIvaine缓冲溶液中，使其溶解，摇匀。

实验所用的鸡肉取自当地超市。

1.2 实验方法

1.2.1 色谱条件

色谱柱：Venusil ASB-C18(4.6 mm×250 mm)；检测器：二极管阵列检测器；柱温：30 ℃进样量：20 μL；流速：1 mL/min；检测波长：357 nm；流动相：A（甲醇∶乙腈=3∶7）∶B（0.01 mol/L 柠檬酸水溶液）=27∶73。

1.2.2 标准曲线的绘制

取浓度为10 mg/L的四环素类抗生素混合标准溶液，以甲醇为溶剂，逐级稀释为1.0 mg/L、0.8 mg/L、0.5 mg/L、0.2 mg/L、0.1 mg/L。以浓度为横坐标，对应的峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.3 分子印迹聚合物的制备

取119 mg TC、175 µL MAA、3 mL乙腈、2 mL甲醇置于50 mL圆底烧瓶中，振荡30 min；向圆底烧瓶中加入760 µL EGDMA，振荡15 min；再加入50 mg AIBN，振荡5 min；60 ℃水浴聚合48 h。反应完成后将聚合物材料研磨至粉末状，利用甲醇乙酸混合溶液（9∶1，V/V）洗脱至无 TC 检出。用去离子水反复冲洗2～3次，60 ℃烘干至恒重，待用。非印迹材料除了不加模板分子外，其他的步骤相同。

1.2.4 材料吸附性能表征

1.2.4.1 吸附动力学实验

准确称取25.0 mg分子印迹聚合物材料，加入5 mL 30 mg/L的 TC-甲醇溶液，分别在室温下振荡 5 min、10 min、20 min、30 min、60 min 后，5000 r/min离心15 min。在波长357 nm条件下，采用紫外-可见分光光度计测定上清液中TC的吸光度。按照公式（1）计算聚合物对TC的吸附量。

式中，C0和Ct分别代表吸附前和吸附后 TC的浓度（mg/L），V表示加入TC的体积（mL），m为聚合物质量（mg）。

1.2.4.2 平衡结合实验

为了考察所制备的分子印迹聚合物对TC的结合能力，准确称取25.0 mg印迹材料和非印迹材料，分别加入5 mL不同浓度的TC-甲醇溶液（20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、70 mg/L、100 mg/L）振荡30 min，5000 r/min离心15 min。在357 nm的波长下，采用紫外-可见分光光度计测定上清液中TC的吸光度，按照公式（1）计算聚合物对TC的吸附量。

1.2.4.3 选择性结合实验

为了考察聚合物对3种四环素类抗生素的特异性吸附，选择与四环素类抗生素结构类似的SMZ、SCP作为竞争物。准确称取25.0 mg印迹材料和非印迹材料于50 mL容量瓶中，各加入5 mL 10 mg/L的TC、OTC、DC、SMZ、SCP的混合甲醇溶液，振荡30 min，5000 r/min离心15 min。通过HPLC检测上清液中各分析物浓度，四环素类抗生素的测定波长为357 nm，磺胺类药物为270 nm。通过比较吸附前后上清液与标准溶液浓度，计算每种物质的吸附量、分配系数（Kd）、选择性系数（K）和相对选择性系数（K’）。计算公式如下：

1.2.5 样品处理

准确称取5.0 g鸡肉样品置于50 mL离心管中，加入20 mL 0.1 mol/L的Na2EDTA-MclIvaine缓冲溶液，涡旋混合1 min，冰水浴超声提取10 min，3000 r/min离心5 min；重复提取两次，合并上清液，过0.45 μm滤膜，待净化。

准确称取0.25 g聚合物材料，填充于5 mL的空的聚丙烯固相萃取柱中的底端筛板上，顶端用聚丙烯筛板压实。填充完毕后，用5 mL的甲醇和5 mL水预处理，保持柱体湿润；取待净化的样品，以1 mL/min的速度过固相萃取柱，待样液完全流出后，依次用 5 mL水和5 mL 5%甲醇水溶液淋洗，弃去全部流出液；用10 mL甲醇和乙酸混合溶液（9∶1，V/V）洗脱，收集洗脱液；将洗脱液在N2下吹干，用1 mL甲醇复溶，过0.45 µm滤膜，待测。

1.3 数据处理

实验数据处理及作图采用Origin 8.6软件和Excel 2016。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

图1 四环素紫外吸收曲线Fig.1 The UV absorption curve of TC

取 TC标准溶液，利用紫外-可见分光光度计在400～190 nm范围内进行全波长扫描。结果如图1所示。由图可知。TC在270 nm处和357 nm处吸收峰较大，但在270 nm处干扰物较多，因此选择357 nm作为TC的最佳检测波长。

2.2 流动相的选择

图2 1 mg/L的TC-甲醇标准溶液液相色谱图Fig.2 The HPLC chromatogram of 1 mg/L TC-Methanol solution

四环素类抗生素具有酸碱两性，但在弱酸环境中比较稳定，过酸或碱性均易失效，因此选用的流动相应为弱酸性。参考文献[15,16]的方法，选择 0.01 mol/L的柠檬酸作为水相，甲醇和乙腈混合溶液作为有机相，并对甲醇与乙腈的比例，水相与有机相的比例进行了优化。实验结果表明，当甲醇∶乙腈=3∶7，有机相∶水相=27∶73时，3种四环素类抗生素能够完全分离，且所用时间最短。标准品色谱图如图2所示。

2.3 分子印迹聚合物吸附性能表征

2.3.1 吸附动力学实验

图3 30 mg/L TC-甲醇溶液在25 mg分子印迹材料上的吸附动力学Fig.3 The adsorption kinetics of 30 mg/L TC-methanol solution on 25 mg molecularly imprinted materials

为了评价制备的聚合物的传质速度，测定了不同时间下（5～60 min），25.0 mg聚合物对30 mg/L的TC-甲醇溶液的吸附量（图3）。由图3可知，吸附5 min后，吸附容量达到最大吸附容量的83.0%，30 min基本达到吸附平衡，说明合成的材料具有较快的传质速度。如果四环素的浓度更低，达到吸附平衡的时间会更短。

2.3.2 平衡结合实验

为了评价合成的聚合物对模板分子TC的结合能力，在室温下测定印迹聚合物和非印迹聚合物对20～100 mg/L的TC吸附量的变化趋势，以TC浓度为横坐标，吸附量为纵坐标，绘制TC吸附等温线（图4）。由图4可知，随着四环素溶液浓度的增加，印迹聚合物和非印迹聚合物对TC的吸附量均有不同程度的增加。但印迹聚合物的吸附量要明显高于非印迹，当TC的初始浓度为100 mg/L时，印迹聚合物和非印迹聚合物对 TC的吸附量分别为 2.30 mg/g和 1.13 mg/g，印迹聚合物对四环素的吸附量大约是非印迹聚合物吸附量的2.04倍，说明相较于非印迹聚合物，印迹聚合物对模板分子的吸附性较好。

2.3.3 选择性吸附

为了评价印迹聚合物对四环素类抗生素的选择性，分别选择印迹材料与非印迹材料对三种四环素类抗生素、SMZ、SCP进行竞争吸附，结果见表1。由表1可知，印迹材料对四环素类抗生素的吸附量要大于非印迹材料对四环素类抗生素的吸附容量，且印迹材料对四环素类抗生素的吸附量大于对SMZ、SCP的吸附量，印迹材料的Kd大于非印迹材料的Kd，印迹材料对四环素类抗生素的K小于SMZ、SCP，SMZ、SCP的K’均大于1，说明印迹材料对3种四环素类抗生素具有较强的选择识别性。其原因主要是在聚合过程中，TC与MAA的键合，使配体进行有序的排列，从而形成了一定的立体化学结构。洗脱除去模板后，形成了特定的空穴，该空穴使得聚合材料具有一定的特异性。而非印迹聚合物中没有特定的空穴，只是依靠化学性或物理性吸附，所以具有较低的选择性。

表1 印迹材料与非印迹材料对四环素类抗生素、SMZ、SCP的竞争吸附结果Table 1 Competing adsorption results of tetracyclines, SMZ and DMP between imprinted and non-imprinted materials

2.4 分析方法特征量

2.4.1 线性关系和方法检出限

将四环素类抗生素混合标准溶液（0.1～1.0 mg/L）在选定的色谱条件下进行测定，线性方程见表 2。在相同条件下，重复进样 5次，验证方法的精密度（RSD）。根据S/N=3计算方法的检出限。结果见表2。由表2可知，在0.1～1.0 mg/L范围内，3种四环素类抗生素的线性关系良好（R2＞0.99），方法对OTC、TC、DC 3种四环素类抗生素的最低检出限分别为 0.12 μg/L、0.13 μg/L、0.14 μg/L，RSD 分别为 1.27%、1.31%、1.94%。

表2 方法的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及精密度Table 2 Linear range, linear equation, correlation coefficient, LOD and RSD of SPE-HPLC

表3 鸡肉样品的加标回收率Table 3 The recoveries of spiked chicken sample

2.4.2 方法的加标回收率

图5 空白样品（a）、加标样品（50 μg/kg）（b）的色谱图Fig.5 Chromatograms of blank samples(a), spiked samples(b)

为了评价所建立方法的准确性和适用性，选用当地超市的鸡肉样品，测定样品中3种分析物的残留情况。经测定，确定鸡肉样品中未检出目标分析物。为了进一步证明所建方法的准确性，对样品进行添加回收实验，添加样品后 3种分析物的最终浓度为 50 μg/kg，100 μg/kg 和200 μg/kg。对样品进行提取后，固相萃取富集净化，收集洗脱液，吹干后用1 mL甲醇复溶，过0.45 µm滤膜，待液相检测。每个浓度平行测定3次，计算平均加标回收率及RSD，见表3。实际样品的色谱图见图5。由表可知，鸡肉中的3种四环素类抗生素的加标回收率为 80.94%～94.95%，RSD为1.04%～3.63%，可以满足鸡肉中痕量四环素类抗生素的痕量检测要求。由图5可知，样品色谱图中的杂峰较少，说明该样品前处理方法可以有效的去除食品基质的干扰。

3 结论

实验结果表明，本方法合成的分子印迹聚合物对3种四环素类抗生素（四环素、土霉素、强力霉素）具有较强的吸附性和特异识别性，并用该聚合物材料作为固相萃取柱填料，制备固相萃取柱，建立了固相萃取与高效液相色谱联用技术同时检测鸡肉中3种四环素类抗生素残留的方法。该法将富集、净化和检测为一体，简单、快速且灵敏度高，可以用于实际样品中四环素类抗生素的检测。