李敏雄，郭斌，刘飞，曹庸

（1.华南农业大学食品学院，广东省天然活性物工程技术研究中心，广东广州 510642）（2.广州绿萃生物科技有限公司，广东广州 510665）

目前胶原蛋白及活性肽被广泛应用于生物、医疗、食品、化妆品、饲料、皮革和影像等诸多领域[1]。胶原蛋白肽因其弱的抗原性、低过敏性、易水解、原料廉价易得和良好的生物相容性，受到众多行业的青睐[2]。水产胶原蛋白活性肽具有保护胃粘膜、抗溃疡、抗氧化、抗过敏、抗肿瘤、抗衰老、降血压、降胆固醇、增强骨强度、预防骨质疏松、预防关节炎、促进伤口愈合、促进角膜上皮细胞的修复和生长、促进皮肤胶原代谢、免疫调节等多种生理功能[3]。相对分子质量低的小肽易被肠道吸收，且在体内生理功能不易被破坏[4]。

罗非鱼是我国养殖量居于第二位的鱼种[5]。2016年产量为186.64万吨[6]。目前，罗非鱼的生产加工主要以出口冷冻鱼肉片为主，加工过程产生的下脚料占全鱼重的60%~70%，包括鱼皮、鱼头、鱼鳍和鱼骨[7]。这些副产物中含有丰富的蛋白质，其中鱼皮中含有的胶原蛋白最为丰富[8]，但鱼皮副产物大部分作为饲料鱼粉的原料或废料丢弃，既污染了环境，又造成了经济上的损失[9]。对这些鱼皮进行有效利用，避免浪费的同时还可减少环境污染[10]。长期以来，胶原主要来源于猪、牛等陆生动物，但是随着疯牛病、口蹄疫的频发以及宗教和文化的差别，猪、牛来源胶原的应用受到了限制[11]。在这种背景下，水产胶原的研究和应用逐渐受到科研工作者的重视。由于罗非鱼皮的丰富来源及安全性因素，使得近年来罗非鱼皮成为了新的胶原蛋白肽来源，从罗非鱼皮中提取胶原蛋白肽已经成为了当前研究的热点[12]。因此如何将这些加工过程中产生的鱼皮废弃物变废为宝成为了研究的关键[13]。虽然目前已有大量罗非鱼皮制备胶原蛋白肽的报道，但是还存在工艺研究不够系统严谨、方法指标选择不够科学、鱼皮脱脂效果差导致其胶原蛋白肽品质差等问题。为了解决这些问题，本课题在前人的基础上，重点在这些方面进行研究工作。

由于酶水解法相比于热水抽提法、酸水解法、碱水解法条件温和，能在一定条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且氨基酸不会被破坏，构型也不发生变化，所以近年来多被采用于鱼皮的降解中[14]。本课题旨在利用沿海地区淡水养殖的罗非鱼加工下脚料-鱼皮为原料，以水解度、水解产物分子量和感官评价为指标，以碱性蛋白酶水解法，通过单因素试验和响应面试验确定富含低分子量的罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽制备的新型制备工艺。为生产鱼皮胶原肽产品提出了新的思路，为工业化提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

罗非鱼皮，广东省明基水产品有限公司；碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、和胰蛋白酶，广西南宁庞博生物工程有限公司；胃蛋白酶，广州市齐云生物技术有限公司；邻苯二甲醛(OPA)，上海麦克林生化科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

低温连续相变萃取装置，自制；DELTA320型pH计，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；电热恒温数显水浴锅，上海一恒科学仪器有限公司；水浴恒温振荡器，常州国华电器有限公司；UV-1750型紫外可见分光光度计，岛津（中国）有限公司；LC-10A型高效液相色谱仪（配有紫外检测器），日本岛津公司；TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm凝胶柱，东曹（上海）生物科技有限公司；L530台式低速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酶解工艺

称取一定量脱脂的干制罗非鱼皮，常温按照1:20添加三级水浸泡2 h，用蒸馏水洗样品并过滤，重复3次。置于三角瓶中，按料液比1:15加入三级水，料液在酶解前经热处理，即在85 ℃条件下，热处理20 min。冷却至室温后，分别在各酶的最适温度下预热10 min后，用5 mol/L HCl溶液或5 mol/L NaOH溶液调节至各酶的最适pH。然后加入一定量的蛋白酶启动水解反应，置于酶的最适温度下恒温酶解。待酶解反应进行一定时间后，立即将水解混合物从恒温摇床内取出，将水解液的温度升高至95 ℃并持续加热20 min以使酶失活。冷却至室温，然后4500 r/min离心15 min，收集上清液，用水定容。

1.3.2 酶解单因素实验

1.3.2.1 加酶量对酶解反应的影响

固定料液比1:15、温度50 ℃、pH 8.0、酶解时间6 h，考察不同加酶量（1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%）对水解度的影响。

1.3.2.2 pH对酶解反应的影响

固定料液比1:15、温度50 ℃、加酶量5%、酶解时间6 h，考察不同酶解pH（7.0、8.0、9.0、10.0、11.0）对水解度的影响。

1.3.2.3 温度对酶解反应的影响

固定料液比1:15、pH 8.0、加酶量5%、酶解时间6 h，考察不同酶解温度（45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃）对水解度的影响。

1.3.2.4 时间对酶解反应的影响

固定料液比1:15、温度50 ℃、pH 8.0、加酶量5%，考察不同酶解时间（1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h、8 h、10 h）对水解度的影响。

1.3.3 响应面优化设计

在以上单因素实验基础上，采用 Design-Expert 8.05b软件中Box-Behnken中心组合设计原理进行响应面实验设计，具体选取加酶量、pH、温度及时间四个因素，进行提取工艺优化研究。

1.3.4 分析测定方法

1.3.4.1 罗非鱼鱼皮基本组分的测定

水分：GB 5009.3-2016《食品安全国家标准 食品中水分的测定》；灰分：GB 5009.4-2016《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》；总蛋白：GB 5009.5-2016《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》；脂肪：GB 5009.6-2016《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》。

1.3.4.2 水解度的测定

水解度的测定采用OPA法[15,16]。1.3.4.3 样品分子量分布的测定

参照文献[17]，利用高效液相色谱仪进行测定，并用相关软件进行分析。色谱柱为TSKgel G2000 SWXL 300 mm×7.8 mm，流动相为水/乙腈/三氟乙酸（80:20:0.1，V/V/V），在柱温为室温、流速为0.5 mL/min条件下，以检测波长220 nm对样品进行测定。其中绘制分子量标准曲线所选取的蛋白标准品为：细胞色素C(12500 u)、胰岛素(5808 u)、杆菌肽(1422 u)、杆菌肽(1422 u)、甘氨酸-甘氨酸-酪氨酸-精氨酸(451 u)、甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸(189 u)。

1.3.4.4 胶原蛋白肽粉的感官评定

参照文献[18,19]，培养10名感觉器官机能良好的检察人员对胶原蛋白肽粉从色泽、腥味以及滋味三方面进行感官评价，并按照表1填写评价表格；对10名检查人员的感官评价作统计并计算分析，分值越小表明测定结果越好。

表1 感官评定标准Table 1 Index of organoleptic investigation

1.3.4.5 统计分析

结果以X±S表示。采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理和分析。

2 结果与讨论

2.1 罗非鱼鱼皮主要成分分析

罗非鱼皮原料冷冻条件下运送至本实验室后，经过自来水清洗，沥干后在室外晾晒，接着低温干燥并粉碎后备用。罗非鱼鱼皮的化学组成见表2。

表2 罗非鱼鱼皮的化学组成Table 2 Nutrient content of tilapia

从表2可以看出，罗非鱼鱼皮水分含量为10.25%、蛋白质含量为76.98%、脂肪含量为9.50%，灰分含量为 1.22%。总的来说罗非鱼鱼皮蛋白质含量很高，很适合高值化利用，但是鱼类加工下脚料常常不可避免的含有脂肪，较高的脂肪含量会降低蛋白酶的酶解效果，同时在酶解过程中脂肪氧化后生成的可溶性小分子醛、酮具有不良气味，少量的脂肪残留在酶解过滤液中，会造成产品品质下降[20]。

罗非鱼鱼皮脂肪含量偏高，因此在加工过程中脱脂显得更加关键。本研究采用具有自主知识产权的低温连续相变提取技术[21]对罗非鱼鱼皮油脂进行提取，参考前期研究得到的最佳提取工艺：萃取时间50 min，萃取温度50 ℃，萃取压力0.5 MPa，解析温度70 ℃，物料水分为10.25%，此时提取率达到90%以上，脱脂后的鱼皮脂肪含量仅为0.70±0.10%，为后期制备高品质罗非鱼皮胶原蛋白肽奠定了基础。

2.2 水解蛋白酶的选择

分别选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、风味蛋白酶、胰蛋白酶和胃蛋白酶，按照蛋白酶各自的最适作用温度和pH值，酶解脱脂后的鱼皮原料。不同蛋白酶对罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽水解度、分子量及感官的影响见表3。

从表3可以看出，不同蛋白酶酶解鱼皮后的水解度、分子量分布及感官评价有显著性的差异（p<0.05）。其中风味蛋白酶的水解度最高，为 27.07±0.11%，胃蛋白酶的水解度最低，为1.40±0.14%，六种蛋白酶的水解度从高到低排序是风味蛋白酶>木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>碱性蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶，说明风味蛋白酶的水解能力最强，同时其是外切酶，故鱼皮蛋白大部分水解成了多肽或者氨基酸。

据相关文献报道，罗非鱼皮氨基酸组成中相对分子质量最大的氨基酸是酪氨酸（181 u），表明相对分子质量在 180~1000 u之间的物质主要是氨基酸残基在2~8个之间的小肽（寡肽）[22]，与氨基酸、多肽和蛋白质相比，寡肽更易被机体吸收且具有独特的生物活性[17]。木瓜蛋白酶的分子量 180~1000 u的含量最高，为 72.23±0.46%，胃蛋白酶的含量最低，仅为9.26±0.42%，六种蛋白酶的180~1000 u的含量从高到低排序是木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>碱性蛋白酶>风味蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶，虽然风味蛋白酶的水解度最高，但其分子量 180~1000 u的含量较低，仅为54.56±0.43%。

从产品的角度考虑，不仅水解度要高、分子量分布要合理，感官品质还要优良。表中不同蛋白酶的色泽没有显著性差异（p>0.05）。腥味是影响品质的关键指标之一，木瓜蛋白酶的腥味最大，为4.74±0.07，碱性蛋白酶的腥味最小，为2.36±0.08，六种蛋白酶的腥味从大到小排序是木瓜蛋白酶>中性蛋白酶>胃蛋白酶>风味蛋白酶>胰蛋白酶>碱性蛋白酶，说明木瓜蛋白酶的腥味最重，但碱性蛋白酶的腥味最小，感官评价优良。木瓜蛋白酶的滋味最咸，为4.60±0.07，胃蛋白酶的滋味最小，为3.07±0.06，六种蛋白酶的滋味从大到小排序是木瓜蛋白酶>碱性蛋白酶>中性蛋白酶>风味蛋白酶>胰蛋白酶>胃蛋白酶。

综上所述，最终选择碱性蛋白酶作为最适合的水解用酶，其水解度为18.97±0.09%，分子量180~1000 u的含量为 67.74±0.51%，色泽为 2.45±0.07，腥味为2.36±0.08，滋味为 4.08±0.07。

表3 不同蛋白酶对罗非鱼鱼皮胶原蛋白肽水解度、分子量及感官的影响Table 3 Effect of protease on hydrolysis degree, molecular weight and organoleptic investigation of collagen peptide from tilapia skin

2.3 加酶量对酶解反应的影响

图1 加酶量对水解度的影响Fig.1 Effect of the enzyme concentration on DH

由图1可知，在加酶量小于6%时，水解度随加酶量的增加而增加，在加酶量达到 6%时，水解度达到最大值，在加酶量大于 6%时，水解度增加缓慢。碱性蛋白酶水解鱼皮的本质是蛋白酶分子的络合位点与鱼皮蛋白质分子中某些特有的氨基酸残基结合，其催化位点通过降低反应的活化能而使特有肽键容易断裂和产生。因此，在加酶量为1%~6%时，鱼皮过量，酶不够，即酶已被底物饱和。此时，随着酶的增加，蛋白酶与底物蛋白分子接触并结合形成酶-底物络合物的量也增加，水解度增加。但当加酶量达到6%时，底物被酶饱和，酶促反应速度变缓，水解度增加变缓。因此，选定碱性蛋白酶最适加酶量是6%。

2.4 pH对酶解反应的影响

由图2可知，pH在5.0~10.0时，水解度随pH的增加而增大。当pH为10.0时，水解度达到最大值，之后继续增大pH，水解度开始下降。pH在5.0~10.0范围时，pH值的增加可促进碱性蛋白酶和鱼皮蛋白溶解并使其处于一定的解离状态，它能促进酶与底物蛋白形成酶-底物络合物以及增强蛋白酶活性，从而增强酶解反应发生和水解度的增大；但当pH大于10.0时，此时蛋白酶和底物蛋白溶解性减弱，酶与底物蛋白形成的蛋白酶-底物络合物量减少，蛋白酶甚至变性失活，酶解反应减弱，水解度下降。因此，选定碱性蛋白酶最适水解pH为10.0。

图2 pH对水解度的影响Fig.2 Effect of the pH value on DH

2.5 温度对酶解反应的影响

图3 温度对水解度的影响Fig.3 Effect of the enzymolysis temperature on DH

从图3可知，在45~60 ℃内水解度随温度升高变化较快，当温度进一步升高时水解度不再升高反而有所下降。在45~60 ℃范围内，温度的上升能促进碱性蛋白酶蛋白酶和鱼皮蛋白的溶解，加强酶与底物的接触，形成酶-底物络合物。同时，加热可以降低酶促反应所需的活化能，促进酶促反应的发生和水解度的增大。当温度高于60 ℃时，随着温度的上升酶变性失活及酶总活性下降，酶与底物蛋白之间的交链聚合也加重，聚合物不溶于水，从而削弱底物蛋白的溶解和蛋白酶的活性，水解度降低。因此，选定碱性蛋白酶最适水解温度为60 ℃。

2.6 时间对酶解反应的影响

图4 时间对水解度的影响Fig.4 Effect of the enzymolysis time on DH

由图4可知，在碱性蛋白酶作用下，最初的6 h内水解度增加的幅度较大；随着水解时间的延长，水解度不断增大，到6 h时，水解度趋向稳定。此后，随时间的延长水解度变化不大。在6 h内，底物含有大量肽键，产物对酶促反应的抑制作用很小。蛋白酶变性、自溶和（或）“钝化”失活的概率较低，它可以促进酶-底物络合物的形成和水解度的升高。但是时间超过6 h时，肽键的数目减少，产物对酶促反应的削弱作用增强，蛋白酶变性、自溶和（或）“钝化”失活增加，酶-底物络合物的量减少以及水解度增加缓慢。因此，选定碱性蛋白酶最适水解时间为6 h。

2.7 响应面实验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken响应面法的要求，选取影响胶原蛋白肽水解度的四个因素：时间、加酶量、温度、pH。采用四因素三水平的响应面分析方法，利用Design-Expert 8.05b软件进行数据拟合，分析因素与水平设计如表4所示。试验结果见表5。

经过多元回归拟合，得到回归方程模型：

表4 响应面分析因素与水平Table 4 Factors and levels of RAS test

表5 响应面分析方案及结果Table 5 Experiment design and results of response surface

由回归模型的方差分析可知（表6），该回归模型达到极显著水平(p<0.0001)。由表中P值可知，4个因子都对胶原蛋白肽水解度具有显著性影响。逐项显著性结果检验表明：方程中一次项A、B、C、D，二次项A2、B2、D2及交互项AB对胶原蛋白肽水解度影响显著，其余项影响均不显著。该拟合模型相关系数R2=0.9672，说明响应值（水解度DH）的变化有96.72%来源于所选变量，即时间、加酶量、温度、pH值。失拟项不显著(P=0.1671)，说明该回归方程的拟合度高，可较好地描述各因素与响应值的真实关系。

软件分析，得出最优的碱性蛋白酶水解条件为：时间7 h、加酶量7%、温度60 ℃、pH值10.38，在此条件下碱性蛋白酶水解罗非鱼皮的水解度预测值为22.78%。经试验验证，此最优条件下水解度为23.01%，与预测值的相对误差在1.0%左右，证明在实际生产中应用该模型进行预测是可行的。

表6 二次响应面方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model

2.8 最优水解条件的胶原蛋白肽相对分子量的分布

图5 酶解产物的高效凝胶液相色谱图Fig.5 The hydrolysates weight chromatography by HPLC

用最优的组合方法酶解鱼皮获取的胶原蛋白肽为有轻微腥味和较弱苦涩味的白色粉末，酶解产物相对分子质量分布曲线如图 5，相对分子质量分布测定结果如表6。

表7 酶解液分子质量分布测定结果Table 7 Determination results for the molecular weight distribution of the hydrolysates

由表7可见，分子质量在180~1000 u之间的物质占 70.70%，即表明酶解液中寡肽含量较高，占比为70.70%，而寡肽具有独特的生理活性且更易被机体吸收。蛋白质及多肽因为理化阻碍和代谢阻碍等原因需要在胃肠道内被降解为2~5个氨基酸残基小肽或直接降解成为游离氨基酸才能被吸收。寡肽（主要是二肽和三肽）和氨基酸存在两种互相独立的吸收转运系统，短链肽可以通过两类肽运载体直接吸收进入血液，吸收速度快，生物活性显著[23]。寡肽比大肽更易吸收，寡肽中的二肽和三肽能被完整的吸收，而肠道对于大于三肽的寡肽的吸收慢于二肽、三肽，且在肠道内进一步水解为二、三肽后才能被人体完整的吸收利用[24]。但也有研究发现四肽、五肽甚至六肽都能被吸收[25]。有证据表明，含有脯氨酸、羟脯氨酸的寡肽易于被吸收进入门静脉并在血液中以完整的形式出现，这些肽对细胞内肽酶有一定的抵抗力[26]。根据日本德国的研究，分子量180~1000 u之间的胶原蛋白肽具有较好的生理活性及能够被人体很好的吸收和利用，因此广泛应用于保健食品、化妆品、医药行业作为功能因子有巨大的开发价值。

3 结论

本文以罗非鱼鱼皮为原料，研究利用酶法制备胶原蛋白肽制品。测定了罗非鱼皮的基木组成成分，利用低温连续相变萃取技术对鱼皮进行脱脂处理，脱脂后的鱼皮脂肪含量仅为0.70±0.10%。综合比较水解度，分子量分布及感官评价情况对蛋白酶筛选确定碱性蛋白酶为最适合的水解酶；再通过单因素实验和响应面试验对鱼皮胶原肽制备工艺进行优化酶解的最佳工艺条件为：时间7 h、加酶量7%、温度60 ℃、pH值10.38，在此条件下碱性蛋白酶水解罗非鱼皮的水解度最高可达23.01%。碱性蛋白酶最佳工艺条件生产的胶原蛋白肽经评定小组的感官评定，结果为有轻微腥味和较弱苦涩味的白色粉末。对其分子量进行测定，发现该胶原蛋白肽的分子量分布较好，分子质量180~1000 u之间的寡肽（约2~8个氨基酸残基）占70.70%。因此，本文为生产鱼皮胶原肽产品提出了新的思路，为其工业化提供了理论支持。