安飞宇，武俊瑞，解梦汐，姜静，邱博书，唐筱扬，乌日娜

（沈阳农业大学食品学院，辽宁沈阳 110866）

豆酱又名黄豆酱、黄酱或大豆酱，是以大豆为主要原料制得而成，经自然发酵而成的半流动状态的发酵食品，在我国北方地区称为大酱[1]。传统发酵豆酱作为日常的调味品，因其独特的风味在中国、日本[2]、韩国[3]都深受人们的喜爱。豆酱中富含大豆蛋白质、蛋白黑素、肽类、异黄酮和维生素等[4]。最近，豆酱引起人们广泛的关注，不仅是因为其丰富的营养价值，还因为豆酱具有抗氧化性[5]、抑制血清胆固醇上升、降血压[6]、抗诱变性[7]和抗癌[8]等保健功能。

传统的豆酱制作工艺分为两个阶段，分别为制块阶段及制酱阶段。制块阶段较为重要，酱块可以给豆酱提供丰富的细菌及真菌，进而使其产生独特的风味。近年来，工厂通过纯种发酵的方法生产豆酱，缩短了生产周期并保持产品稳定性。然而工业化豆酱菌种单一，使豆酱的酱香、风味和适口性远不及传统发酵豆酱[9]。因此，研究传统发酵酱块中的微生物多样性至关重要。2010年Lee等应用DGGE技术研究了韩国酱块微生物群落，发现了芽孢杆菌（Bacillus）和耐久肠球菌（Enterococcus durans）为主要细菌；犁头霉(Absidia)、曲霉（Aspergillus）和假丝酵母（Candida）为主要真菌[10]。2014年孙雯等应用纯培养的方法鉴定出豆酱中的霉菌有米曲霉(Aspergillus oryzae)、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、犁头霉属(Absidia)、大毛霉组(Mucedo)及曲霉属(Aspergillus)[11]。目前国内外对豆酱的微生物多样性、加工工艺等做了大量研究，但对于东北传统自然发酵豆酱酱块的研究涉及甚少且主要集中于对其真菌的研究[3,10]。

近年来测序技术不断的进步，越来越多的研究者利用新一代测序技术对发酵食品微生物进行分析。2014年焦晶凯等采用第二代测序 Illumina MiSeq方法，全面的展现了内蒙古四个不同地区的自然成熟干酪中的细菌微生物多样性[12]。2016年陈泽斌等首次应用Illumina MiSeq高通量测序技术分析玉米内生细菌多样性，全面而准确地分析了玉米内生细菌的种类组成[13]。本试验采用高通量测序技术分析了传统酱块发酵过程中真菌和细菌的群落演替，揭示传统发酵豆酱微生物群落特征，为提高豆酱品质奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品的制作工艺及采集

样品采自开原传统自然发酵豆酱酱块。春季制酱块，采用传统工艺室温发酵，具体生产工艺为：取新鲜的大豆，去掉杂质后浸泡12 h，蒸煮3~5 h，直至大豆变软，搅碎后制成长方形酱块，自然发酵2个月后制成成熟酱块。从制成酱块起，每隔20 d采集一次样品，样品编号分别为KY 0 d、KY 20 d、KY 40 d、KY 60 d。取样后置于冰盒中，并迅速转移至-80 ℃冰箱保藏。

1.2 主要试剂与仪器

基因组DNA提取试剂盒（离心柱型），PCR引物由金唯智公司设计，Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)，Qubit2.0 Fluorometer (Invitrogen,Carlsbad, CA)，MetaVx™文库构建试剂盒(GENEWIZ,Inc., South Plainfield, NJ, USA)，Illumina MiSeq(Illumina, San Diego, CA, USA)，Agilent 2100 生物分析仪(Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA)等。

1.3 样品总DNA的提取

按照参考文献[14]的方法提取酱块的总 DNA，使用Qubit 2.0 Fluorometer (Invitrogen, Carlsbad, CA)检测DNA样品的浓度。琼脂凝胶电泳检测DNA的完整性。所提取的DNA于-20 ℃保存备用。

1.4 PCR扩增及测序

以 50 ng DNA 为模板，用上游引物（CCTACGGRRBGCASCAGKVRVGAAT）和下游引物(GGACTACNVGGGTWTCTAATCC)扩增细菌 16S rRNA基因的 V3和 V4区，同时使用上游引物（GTGYCAGCMGCCGCGGTAA）和下游引物（CTTGTGCGGKCCCCCGYCAATTC）扩增细菌16S rRNA基因的V4和V5区。并在其PCR产物的末端加上含有Index的接头。

以 50 ng DNA为模板。使用上游引物（ACCTGCGGARGGAT）和下游引物（GAGATCCRTTGYTRAA）扩增真菌的ITS1区，用上游引物（GTGAATCATCGARTC）和下游引物（TCCTCCGCTTATTGAT）扩增真菌的ITS2区。并在其PCR产物末端加上含有Index的接头。

采用Agilent 2100生物分析仪对文库质量进行检测，并且通过Qubit和实时定量PCR检测文库浓度。DNA文库混合后进行双端测序(PE)，通过MiSeq工具中的MiSeq Control Software (MCS)进行图像分析和碱基识别。

1.5 数据分析

在Illumina basespace云端计算平台进行初始分类分析[14]，以16S rDNA序列97%相似度作为分类操作单元(operational taxonomic unit，OTU)的划分标准。使用QIIME平台计算Chao1多样性指数。对样品中物种多样性信息进行分析，使用 Ribosomal Database Project (RDP) classifier贝叶斯算法对97%相似水平的OTU代表序列进行分类学分析，并在各个水平统计每个样本的群落组成。

2 结果与讨论

2.1 样品复杂度分析

样品的复杂度即Alpha多样性反映微生物的多样性和群落的物种丰富度，包括可操作分类单元（Operational Taxonomic Units，OTUs）数、Chao1指数、Shannon指数等（如表1）。酱块发酵不同阶段共得到细菌的有效序列数为365,765条，平均为91,441条；酱块发酵不同阶段共得到真菌的有效序列数为251,053条，平均为62,763条。样品OTU及Chao1指数可反映微生物群落的物种丰富度，酱块发酵 0 d时细菌和真菌的OTUs数分别为38和40，此时OTUs数最高，说明此时物种最为丰富。酱块发酵20 d时细菌OTUs数为19，40 d时细菌OTUs数为16，60 d时细菌OTUs数为26，可以看出细菌物种丰富度先降低再升高。酱块的各个发酵阶段真菌的OTUs数总体变化不太明显。但除发酵0 d外，真菌的OTUs数明显高于细菌。说明就各个发酵阶段而言，真菌均为优势菌群。

群落生态学可通过样品的Shannon指数来反应微生物群落的多样性，就酱块中的细菌而言，发酵 0 d时多样性最高，后同其物种丰度的变化趋势一致，呈先降低后升高趋势。就真菌而言，其多样性呈先升高后降低趋势。两种截然相反的变化趋势表明，酱块发酵过程中的细菌和真菌可能存在一些相互作用。此前，虽有学者研究表明发酵食品中细菌真菌存在相互作用[15~17]，但所研究大多为单一菌种之间的互作，且鲜有有关传统发酵豆酱中菌群间相互作用的报道。同时值得一提的是，60 d时细菌OTUs数仅为26，但其多样性指数却是所有样品中最高的，说明发酵末期酱块中细菌分布的均匀度较高。此外，所有样品Coverage值均接近于 1，表明覆盖率较高，测序结果代表了样本中微生物的真实情况。

表1 Alpha多样性Table 1 Alpha diversity

2.2 稀释性曲线

图1 酱块发酵不同阶段的稀疏曲线Fig.1 Parefaction analysic of meju in different fermentation stages

采用对序列进行随机抽样的方法，以抽到的序列数与其所能代表OTUs的数目构建稀释曲线。如图1所示，图a为酱块细菌稀释性曲线，图b为酱块真菌稀释性曲线。在<5000条序列时，所测得的OTUs数量随测序深度的增加而迅速增加；在>5000条序列时，所测得的OTUs数目增长速度减慢，最终趋于平台期，说明测序深度合理，能够较为全面地反应酱块各发酵时期微生物多样性变化情况。

2.3 发酵不同阶段门级水平菌群结构分析

图2 门级水平下酱块样品微生物群落变化Fig.2 Microbial community changes in meju samples at the phylum level

对样品中物种多样性信息进行分析，比对数据库可知，酱块发酵不同阶段的细菌主要分四大门，分别为厚壁菌门（Firmicutes）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）和拟杆菌门（Bacteroidetes）。由图2a可知，酱块发酵不同阶段的优势细菌均为厚壁菌门（Firmicutes）(占总数93.02%~99.51%)，其次为变形菌门（Proteobacteria）。

不同发酵时期酱块的真菌组成主要分三大门，分别为接合菌门（Zygomycota）、子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota），且不同发酵阶段优势菌门不同。由图2b可知，在酱块发酵0 d时优势真菌为其他（46.16%），酱块发酵20 d和40 d时优势真菌为接合菌门（占总数59.95%和61.03%），酱块发酵60 d时优势真菌为子囊菌门（占总数53.85%）。由此可知，相对于细菌而言，酱块发酵期间真菌群落变化较大，占主导作用。

2.4 酱块发酵不同阶段属级水平菌群结构分析

图3 属级水平下酱块样品微生物群落变化Fig.3 Microbial community changes in meju samples at the genus level

通过对酱块发酵不同阶段样品进行检测，动态跟踪了整个酱块发酵过程中细菌群落变化。在属水平共检测出细菌40个细菌群落，主要为厚壁菌门中的乳杆菌、魏斯氏菌、肠球菌和明串珠菌等。群落组成如图3a所示。

酱块发酵初期，魏斯氏菌为优势细菌类群达到66.5%。这一结果与陈浩等人的研究结果相似[18]。其次的优势细菌类群为乳杆菌(占总数19.31%)，明串珠菌(占总数 6.26%)为主要细菌类群。此外，梭菌(Clostridium)、乳球菌(Lactococcus)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium)、不动杆菌（Acinetobacter）和肠杆菌（Enterobacter）仅在此阶段（0 d）被检测出，有可能是豆酱酱块在制作过程中，人员、器具或豆子上沾染了杂菌，同时刚制好的酱块湿度高，有助于某些细菌生长，但随着发酵酱块逐渐风干以及微生物之间相互作用，这些细菌的数目会逐渐减少。

酱块发酵中期（20 d和40 d），乳杆菌的数目逐渐增加，最高可达76.12%，成为优势细菌，其次为魏斯氏菌、肠球菌和明串珠菌。肠球菌在发酵0 d和20 d时仅占1.81%和0.11%，在40 d时增长到48.34%，末期60 d降到17.68%。2015年田甜应用高通量测序法检测出中国传统发酵豆酱中肠球菌属和四联球菌属为主要菌种[19]。说明肠球菌不仅在酱块发酵期间起到一定作用，其作用也可以延续至液态豆酱发酵阶段。此外，2009年，Kim等应用DGGE的方法检测出韩国豆酱的主要细菌为明串珠菌、肠球菌和四联球菌[20]。由此可见，肠球菌不仅在中国传统发酵豆酱中起重要作用，在韩国豆酱中也广泛存在，同时也说明有潜在致病菌存在于传统发酵豆酱酱块中，有必要使用分子生物学方法进行检测。

酱块发酵末期 60 d时，乳杆菌(占总数 64.26%)仍为优势细菌，其次为肠球菌(占总数17.68%)和魏斯氏菌(占总数8.13%)。由此可见，乳杆菌为酱块发酵中后期的优势菌种(占总数50.03%和76.12%)，在本研究中，乳杆菌在0 d时含量较低，随着发酵迅速增长后有所减低，最后增长到64.26%，说明乳杆菌在酱块发酵中起到重要作用。并且本研究中乳杆菌主要为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）（占总数2.93%~63.14%）。植物乳杆菌是一种食品及药品管理局（Food and Drug Administration，FDA）认可使用的乳杆菌，在酱油、豆酱中广泛存在[21]，在酶的作用下，可以将精氨酸、组氨酸、天门冬氨酸等氨基酸分解代谢转化成杂醇，对豆酱风味形成起到重要作用。2011年赵建新利用 PCR-DGGE技术在自然发酵豆酱中鉴定出植物乳杆菌、发酵乳杆菌、德氏乳杆菌等[22]。因此，我们认为酱块的发酵对最终成品酱的风味有着一定的影响，其中的乳杆菌起到了重要作用。

此外，一些含量较少但种类较多的微生物及未鉴定出的微生物都被归类为Other，在0 d时为5.55%，中期降到1.33%和0.49%，在末期升到8.33%。这些含量相对较低的微生物可能对维持微生物环境稳定起重要作用，同时也有潜力在适合的环境下变为优势菌群。因此说明影响酱块发酵的微生物群落中不仅包括上述相对含量较多的优势微生物，也还包含许多不能忽视的稀少微生物。

酱块发酵不同阶段共检测出真菌21种。主要为接合菌门中的毛霉菌（Mucor）和根霉菌(Rhizopus)以及子囊菌门中的青霉菌(Penicillium)、链格孢属(Alternaria)、德巴利氏酵母属(Debaryomyces)、单端孢属（Trichothecium）等。如图3b所示，酱块发酵初期0 d时，Other（占总数46.27%）为优势真菌，其次为毛霉菌(占总数18.16%)、青霉菌(占总数15.95%)和根霉菌（占总数15.31%）。此时真菌种类较为丰富，另外根霉菌仅在此时被检测出。相似的结果已有报道，如陈嵘等人在我国多个地区的传统发酵豆酱中均分离出根霉菌，但大多分离自发酵初期的酱醅样品，且生长并不旺盛，不能在整个酱醅发酵过程中占据优势[23]。因此可以认为，根霉菌可能仅在酱块发酵初期起到一定作用，随着发酵的进行，其作用逐渐减小。同时，虽然根霉菌可以产出乳酸、蛋白酶和苹果酸等物质，并已广泛应用于腐乳、酱油等传统发酵食品中[24~26]，但尚未有应用到我国工业生产豆酱中的相关报道。

酱块发酵中期 20~40 d时，毛霉菌(占总数59.94%~61.03%)数目迅速升高并保持稳定，成为优势真菌。20 d时除优势菌属毛霉菌外，其它主要菌属依次为德巴利氏酵母(占总数 24.14%)和青霉菌(占总数14.41%)。酱块发酵40 d时，毛霉菌(占总数61.03%)仍为优势真菌，其次为青霉菌(占总数27.84%)和单端孢属（占总数9.86%）。酱块发酵末期60 d时，毛霉菌(占总数46.11%)仍为优势真菌，其次为链格孢属(占总数 36.14%)和青霉菌(占总数 15.26%)。可以看出，毛霉菌在整个酱块发酵过程中均大量存在，毛霉菌为湿性真菌，酱块的环境有利于毛霉菌的生长。毛霉可以分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等复杂酶系，这些蛋白酶降解蛋白质大分子形成多肽或氨基酸，并协同细菌、酵母的发酵作用，生成一些有机酸、酯类等物质。同时，毛霉菌也是腐乳发酵的主要菌种，其对大豆蛋白有较高的水解率[27~29]。但也有报道称毛霉菌仅在酱块发酵初期为优势菌属，随着发酵的进行，曲霉菌含量不断升高并在发酵中后期逐渐成为优势菌属[30]。此外，本试验中发酵末期被大量检出的链格孢属(36.14%)在其他文献中鲜有报道，鉴于传统发酵豆酱酱块中微生物群落变化研究报道较少的现状，本试验结果与以往研究存在差异，因此我们认为传统发酵豆酱酱块中微生物群落组成与原料组成，取样时间，所在区域，制作方法均有密切联系，还需要进行后续试验及数据积累，以期进一步了解酱块发酵过程中微生物组成差异的原因。

3 结论

3.1 本试验首次应用高通量测序技术分析传统发酵酱块不同阶段的细菌及真菌的群落结构，揭示了传统发酵豆酱酱块在0 d、20 d、40 d、60 d四个发酵阶段中细菌及真菌的群落组成。在门级水平上共检测出细菌四个类群，其中厚壁菌门为优势细菌；检测出真菌三个类群，其中接合菌门和子囊菌门为优势真菌。在属水平上共检测出40个细菌分类群，其中乳杆菌、魏斯氏菌和肠球菌为优势细菌。乳杆菌、魏斯氏菌、肠球菌、明串珠菌和葡萄球菌在各阶段均被检测出。共检测出21个真菌分类群，其中毛霉菌、青霉菌、德巴利氏酵母属和根霉菌为主要真菌。毛霉菌、青霉菌、德巴利氏酵母属、根霉菌假丝酵母、链格孢属、根霉菌和镰刀菌属在发酵各阶段均被检测出。

3.2 近年来，工业生产制作酱块通常添加黑曲霉或米曲霉，但单一的菌种使发酵豆酱的风味远不及传统自然发酵所制作出来的豆酱。本研究发现自然发酵酱块中细菌资源十分丰富，可以将有益细菌如乳杆菌、魏斯氏菌、明串珠菌等混合添加到酱块中发酵，提高商业豆酱的风味及品质。此外，还需结合代谢组学，宏转录组学等其他技术，更加全面地分析酱块发酵过程中微生物的相互作用及其作用机制，从而指导生产。