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HPLC 法测定芪五加颗粒中紫丁香苷的含量

2018-08-16陈文云钟水燕范传园

中兽医学杂志 2018年3期
关键词:五加紫丁香浸膏

陈文云,钟水燕,范传园

(1.江西省兽药饲料监察所,南昌330029;2.江西中成中药原料有限公司,南昌331700)

芪五加颗粒是依据《中药部颁标准》第6册第42页“北芪五加片”的处方、工艺制成的改剂型产品,由黄芪浸膏、刺五加浸膏组方制成的颗粒剂。具有益气,健脾,安神功能,用于家禽免疫低下等。根据有关文献[1],方中黄芪含有皂苷类等有效成分,《中国兽药典》收载的HPLC法测定黄芪中的黄芪甲苷采用蒸发光散射器检测器,适用性、普遍性、经济性不高。另根据文献报道[2]采用柱前衍生化法,研究了本品黄芪甲苷柱前衍生化含量测定方法,结果回收率、精密度、重现性等指标均不符合要求。方中另一味中药刺五加,其有效成分为紫丁香苷,关于紫丁香苷的HPLC测定方法已有很多文献报道[4-6]。为有效控制产品质量,建立HPLC法测定芪五加颗粒中紫丁香苷的含量,并进行方法学考察,结果表明该方法简便快速,重现性、稳定性较好,精密度较高,可作为该制剂的定量控制指标。

1 仪器和试药

1.1 仪器 SyltechLC500高效液相色谱仪(赛尔泰(杭州)科技有限公司);浙大N2000色谱数据工作站;92SM-202A-DR电子天平 (上海普利塞斯国际贸易有限公司);MA110电子天平(上海良平仪器仪表有限公司);101-1AB型电热恒温鼓风干燥箱(北京科伟永兴仪器有限公司);超声波提取器 JL180(220V,50HZ)。

1.2 试药 芪五加颗粒(批号2011050601、2011050801、2011051001),其中黄芪浸膏的工艺来源于“北芪五加片”附注黄芪浸膏的制法,刺五加浸膏的工艺依照文献[3],颗粒剂的成型工艺由江西中成中药原料有限公司研究;紫丁香苷对照品(111574-200502,供含量测定用)购自中国药品生物制品检定所;乙腈为色谱纯,购自上海精细化工有限公司公司;水为二重蒸馏水;其它试剂均为分析纯。

2 方法和结果

2.1 色谱条件 色谱柱:迪马Diamonsil C18(5μm×250mm×4.6mm);流动相:乙腈-水-冰醋酸(10:90:1); 流速:1.0mL/min; 检 测波长265nm;进样量20μL;理论塔板数按紫丁香苷峰计算应不低于2000。

2.2 对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷对照品适量,加甲醇制成每1ml含40μg的溶液,即得。2.3供试品溶液的制备 取本品,研细,混匀,取约5g,精密称定,置 25ml量瓶中,加甲醇 20ml,超声处理30分钟,放冷,再加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。

2.4 线性关系考察 精密称取紫丁香苷对照品12.97mg置于100mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,分别精密吸取2.0、4.0、8.0、12.0、20.0mL置于25mL量瓶中,用甲醇稀释至刻度,即分别得浓度为 10.376、20.750、41.504、62.256、103.760μg·mL-1。按上述色谱条件,分别进样20μL,记录峰面积积分值,以紫丁香苷峰面积积分值(Y)为纵坐标、紫丁香苷进样量(X)为横坐标绘制标准曲线(见图1),计算,得回归方程y=3E+06x+601081(r=0.9991,n=5)。结果表明紫丁香苷含量在为0.2075~2.075μg范围内,与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验 取对照品溶液,按“2.1”项下色谱条件重复进样5次,每次20μL,分别测定峰面积积分值,相对标准偏差为1.12%,表明进样方法的仪器精密性可达到测定要求。

2.6 重现性试验 准确称取同一批芪五加颗粒(批号 2011050601)样品 5 份,分别按“2.3”项下方法处理后进样20μL,结果紫丁香苷峰面积积分值相对平均偏差为1.26%,表明样品处理方法重现良好。

2.7 稳定性试验 取同一对照品溶液和同一供试品溶液, 分别在 0、4、8、12、24 小时进样测定,紫丁香苷对照品峰面积积分值的RSD%为1.14%(n=5),供试品紫丁香苷峰面积积分值的RSD%为1.22%(n=5),说明紫丁香苷至少在24小时内稳定。

2.8 加样回收率试验 取已知含量的芪五加颗粒(批号2011050601)5份,每份约5.0g,精密称定,于每份中分别精密加入紫丁香苷对照品溶液,按供试品溶液的制备方法制备,以上述的色谱条件下,吸取供试液20μL进样,依法测定,计算回收率。结果平均回收率97.91%,RSD=0.97%(n=5)。结果(见表1)。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品测定 取样品3批,按“2.3”项下方法制备供试品溶液并按“2.1”项下色谱条件,对照品溶液与供试品溶液各进样20μL,分别测定紫丁香苷含量(见表2)。

表2 样品中紫丁香苷的含量(n=3)

图1 -标准曲线

图2 -紫丁香苷对照

图3 -芪五加颗粒样品

图4 -芪五加颗粒样品

3 讨论

3.1 流动相的选择 先参照文献[3]收载的刺五加药材和刺五加浸膏中紫丁香苷的HPLC含量测定方法,流动相为甲醇:水(20∶80),结果表明芪五加颗粒中紫丁香苷的峰型前延,分离度较差(见图4)。后根据文献报道[4-6],比较不同比例的乙腈-水、甲醇-水、甲醇-水-冰醋酸、乙腈-水-冰醋酸、甲醇-水-磷酸、乙腈-水-磷酸等多种溶剂系统作为流动相进行考察,结果以乙腈-水- 冰醋酸(10∶90∶1)为流动相,所得紫丁香苷峰形良好,峰形尖锐且对称性好,分离度高,效果较好(见图 2、3)。

3.2 测定波长的选择 通过对紫丁香苷对照品溶液进行全波长扫描,在265nm处有最大吸收。并参考有关文献[4-6],紫丁香苷在265nm处有最大吸收,且紫丁香苷峰基本无干扰,故选择265nm为检测波长。

3.3 供试品处理方式的选择 通过比较水、甲醇、10%甲醇、50%甲醇、乙醇、60%乙醇、正丁醇为提取溶剂,结果采用甲醇作为提取溶剂提取率最高,效果最好。考察了超声处理10min、20min、30min、1h及加热回流30min、1h,结果表明超声30min,紫丁香苷基本提取完全且杂质相对比回流的量要少,故定供试品的提取方法为超声30min。

3.4 结论 本文采用高效液相色谱法测定了芪五加颗粒中紫丁香苷的含量,操作简便,结果准确,可以作为芪五加颗粒的质量控制指标。

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