秦圣豪 韩燕 崔凤 刘译阳 万书波 李国卫

摘要：转录因子是一类具有特殊结构、调控基因表达的蛋白质分子。为了解析转录因子在花生适应盐胁迫环境中的分子机制，本研究以鲁花14号为材料，通过RNA-seq分析花生转录因子在盐胁迫以及恢复后的表达差异。结果表明，在250 mmol/L NaCl处理4 d后，花生中共检测到76个差异表达的转录因子，分别属于13个转录因子家族。其中，根中35个转录因子上调表达，29个下调表达；地上部40个上调表达，17个下调表达。盐胁迫解除后，有35个转录因子不但没有恢复到盐处理前的水平，反而表达量进一步增加。本试验为进一步研究花生转录因子家族在盐胁迫中的作用和提高花生的耐盐性奠定理论基础。

关键词：花生；转录因子；盐胁迫；恢复；RNA-seq

中图分类号：S565.2：Q7文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）06-0041-05

Abstract Transcription factors are a class of protein molecules that have special structures and regulate gene expression. Peanut variety Luhua 14 was used as the material to analyze the molecular mechanism of transcription factors responding to salt stress in peanut through RNA-seq. The results showed that after 4 days of treatment with 250 mmol/L NaCl， 76 differentially expressed transcription factors were detected in peanut， belonging to 13 transcription factor families. After salt treatment， 35 transcription factors were up-regulated and 29 were down-regulated in roots； 40 were up-regulated and 17 were down-regulated in shoots. After recovery， 35 transcription factors did not return to the pre-salt level， in contrast， the expression levels increased. This study lays a theoretical foundation for the further study of the role of peanut transcription factor family in salt stress and the improvement of salt tolerance of peanut.

Keywords Peanut；Transcription factor；Salt stress；Recovery；RNA-seq

盐胁迫是自然界中主要的非生物胁迫之一，是直接影响农作物生产稳定的主要限制因素[1]。盐胁迫不但会破坏细胞膜的完整性，改变膜的渗透性，同时还会在细胞内外形成较强的渗透压力差，使植物吸收水分困难，致使细胞发生水分亏缺[2]。盐胁迫影响植物生长发育、光合作用及呼吸作用等重要的代謝过程，且对植物体内离子含量、酶活性、激素水平等均有影响。为了适应环境变化，植物形成了一系列防御机制以抵御逆境伤害[3]。其中，植物抗逆基因的转录调控对植物抵御逆境胁迫发挥着重要的调节作用。转录调控主要通过特定的转录因子与目标基因启动子区域的顺式元件相互作用来实现[3]。目前发现在盐胁迫条件下能够诱导表达的转录因子主要包括：禽成髓细胞瘤病毒致癌基因同源物类（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog， MYB）、碱性域亮氨酸拉链 （basicdomain leucine-zipper， bZIP）、乙烯应答元件组合蛋白/因子（APELATA2 /ethylene-responsive element binding proteins/factors， AP2/EREBP）、锌指型调控因子（Zinc finger regulator， WRKY）和蛋白N端含有一个新的保守序列的基因（NAC）等[4]。

花生是我国重要的油料和经济作物之一[5，6]。目前，我国食用植物油自给率不足，对花生的需求逐年增大，而耕地面积的不断下降，导致粮油争地矛盾日益突出。因此开展花生耐盐性研究，培育适应盐碱地种植的花生品种，是提高花生产量，避免粮油争地，增加油脂供给的有效手段。

本研究以盐胁迫处理前后的花生品种鲁花14号的根和地上部分为材料，利用转录组测序技术（RNA-seq），鉴定并分析花生响应盐胁迫的转录因子及表达特性，为更深入的了解花生对盐胁迫响应的分子机制，进一步发掘转录因子家族成员的相关功能、鉴定和克隆其重要的耐盐基因，提高花生的耐盐性奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以花生品种鲁花14号为材料，在沙土中萌发7 d后将幼苗移栽到装有2 L Hoagland 营养液的水培盆中，恒温28℃，光照/黑暗：16 h/8 h，相对湿度50%，每周定期更换营养液。

1.2 试验方法

1.2.1 盐胁迫处理 参考Cui等[5]的处理方法，选取18 d大小且生长一致的幼苗进行处理，分成 3 组，其中一组正常培养作为对照（CK），一组250 mmol/L NaCl 处理4 d（N4），一组在盐处理4 d后转移至正常Hoagland 营养液中继续培养3 d进行恢复（R3），每组设置3次重复。收集花生地上部和根，立即放入液氮中冷冻，-80℃保存。

1.2.2 RNA的提取与检测 将冷冻样品在液氮中研磨，利用植物总RNA提取试剂盒（天根）提取总RNA，具体步骤参照试剂盒说明。通过琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，检测合格后送至深圳华大基因科技有限公司进一步确认质量后，进行高通量测序。

1.2.3 Illumina测序 参考Cui等[5]所述的方法，使用Illumina HiSeqTM 2000 测序仪对上述构建的CK、N4及R3转录组 cDNA 文库进行深度测序与组装。

1.2.4 差异基因鉴定与分析 为鉴定花生中响应盐胁迫及恢复后的差异表达基因（DEGs，differentially expressed genes），将测序数据进行RNA-seq分析，使用RPKM （reads per kilo bases per million reads）法计算基因表达量，根据基因表达量（RPKM值）计算其在处理与对照中的差异表达倍数。将差异表达倍数≥2.0、可靠性≥0.8的基因认定为差异表达基因。转录组及RNA-Seq分析的原始数据上传至NCBI的SRA （Sequence Read Archive） 数据库（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/），Bioproject的编号为PRJNA398720。

1.2.5 荧光定量RT-PCR 以分别提取的CK、N4和R3样品的RNA 为材料，使用TaKaRa 公司的PrimeScript RT reagent Kit With cDNA Eraser试剂盒反转

录合成cDNA。利用qRT-PCR 验证RNA-seq数据准确性。PCR反应程序及内参参考Cui等[5]所述方法，引物名称及序列见表1。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫及恢复对花生幼苗的影响

由图1可以看出，N4与CK相比，花生幼苗的生长受到显著抑制，叶片变黄，植株失水，萎蔫严重，受害表现明显（图1B）；而将盐处理的幼苗转入Hoagland 营养液中，花生幼苗的生长并未恢复至正常水平，甚至出现了比盐胁迫更为严重的表型（图1C）。

2.2 转录组测序准确性验证

为了验证测序差异表达基因数据的可靠性，从数据中随机挑选8个差异表达基因，其中N4中2个上调基因Unigene20928 和CL9331.contig1，2个下调基因Unigene21721和Unigene6241；R3中2个上调基因Unigene16871 和CL9331.contig1，2个下调基因Unigene25029和CL4897.contig2。以花生地上部基因CL11012.Contig1和Unigene817以及根中基因Unigene14502和Unigene20560作为盐胁迫和恢复条件的参考基因，进行qRT-PCR验证。结果表明，虽然8个基因在盐胁迫和恢复后的表达程度与测序结果稍有不同（图2、3），但胁迫诱导表达的变化趋势基本一致，说明Illumina测序获得的转录组数据可靠性较高。

2.3 花生盐胁迫下应答转录因子分析

将CK及N4中根及地上部的差异表达基因进行比较分析，共检测到76个转录因子差异表达，分别隶属于13个转录因子家族。由表2可以看出，根中上调表达35个，下调表达29个，其中NAC转录因子家族上调数量最多，共11个；bHLH转录因子家族下调数量最多，共13个，地上部上调表达40个，下调表达17个。其中NAC转录因子家族上调数量最多，共11个；bHLH转录因子家族下调数量最多，共6个。这表明NAC和bHLH转录因子家族在花生盐胁迫响应中起到重要作用。

2.4 花生响应盐胁迫的重要转录因子

根据BLASTP结果对DEGs进行功能注释，我们发现多个盐胁迫标志性转录因子基因显著上调或下调表达（表3）。上调的基因如乙烯响应因子AhAP2（Unigene13934，Unigene13933）和AhERF（CL9645.Contig2），GRAS转录因子AhGRAS（CL6657.Contig1，CL6657.Contig1），GRF转录因子AhGRF（Unigene29805，Unigene29805），MYB转录因子AhMYB（Unigene14467），NAC转录因子AhNAC（CL8911.Contig2，Unigene11981），Trihelix转录因子AhTrihelix（CL3296.Contig2），WRKY转录因子AhWRKY（Unigene11819，CL6093.Contig1），bHLH转录因子AhbHLH（CL6900.Contig3）等。下调的基因如Dof转录因子AhDof（CL7219.Contig4），ERF转录因子AhERF（Unigene13426），MYB转录因子AhMYB（Unigene28340），MYB-related转录因子AhMYB-related（CL9393.Contig1，CL9393.Contig1），TCP转录因子AhTCP（CL10482.Contig1，CL10482.Contig1），bHLH转录因子AhbHLH（Unigene446， Unigene9521）及bZIP转录因子AhbZIP（Unigene26095，Unigene26095）。

2.5 盐胁迫解除后花生转录因子表达分析

为进一步研究盐胁迫恢复3 d后，花生幼苗的生长仍然受到抑制的原因，我们筛选了R3的差异基因，查找出花生中仍有差异表达（未恢复）的转录因子。由表4可以看出，根中未恢復的转录因子13个，地上部未恢复的转录因子22个。其中根中ERF和MYB未恢复的数量最多，共6个；地上部MYB和NAC未恢复的数量最多，共10个。上述转录因子可能是花生幼苗的生长并未恢复至正常水平，甚至出现了比盐处理更为严重表型的原因。

3 讨论与结论

在干旱或者盐碱等逆境胁迫下，植物能够通过改变基因的表达，调控不同代谢和信号的转导途径，在转录和翻译等不同水平上做出响应，而转录因子可在逆境胁迫下激活或抑制下游基因的转录表达。目前已经证实bZIP、WRKY、AP2/EREBP、C2H2、bHLH、MYB和NAC等转录因子家族的成员参与了植物对盐胁迫的应答反应[8]。本研究结果表明，花生在250 mmol/L NaCl处理后，共检测到隶属于13个转录因子家族的76个转录因子有差异表达。其中无论在根或地上部，NAC转录因子家族上调数量最多，而bHLH转录因子家族下调数量最多。推测NAC转录因子家族可能在花生盐胁迫条件下起到正向调节作用。在12个NAC家族转录因子成员中，Unigene11981、Unigene21164、CL8911.Contig2 上调10倍以上，这可能是花生参与盐胁迫应答的重要调节因子。在18个参与花生响应盐胁迫应答过程的bHLH转录因子中，3个表达上调，其中CL6900.Contig3上调50倍以上；13个表达下调，其中Unigene9521 和Unigene446 下调60倍以上，这暗示着bHLH转录因子可能在花生盐胁迫应答中主要起负向调节的作用。另外，在植物特有的WRKY转录因子家族中，有8个WRKY转录因子参与花生的盐胁迫应答过程，且都表达上调，这表明WRKY转录因子在花生盐胁迫响应中起到正向调节的作用。

为进一步研究R3处理后，花生幼苗的生长仍然受到抑制的原因，发现在R3条件下35个转录因子不但没有恢复到盐处理前的水平，反而表达量进一步增加。其中，ERF、MYB、NAC基因家族中未恢复的转录因子最多。推测ERF、MYB和NAC转录因子在花生恢复处理后仍过量表达，导致植物产生额外的应激损害了细胞的稳定性。

本研究通过测序数据分析，初步推断出差异表达转录因子在花生盐胁迫和恢复中的作用，下一步需要进行更多的试验来深入分析其在花生耐盐中的作用机理。例如，盐胁迫强烈诱导MYB转录因子Unigene28340的表达，差异倍数达到700以上。本试验提供了花生盐胁迫响应转录因子候选基因，为转录因子参与植物盐胁迫和恢复的机理研究奠定基础。

参 考 文 献：

[1] 郭金艳. 耐盐性不同的棉花根系转录组比较分析及耐盐基因挖掘[D]. 北京：中国农业大学， 2016.

[2] 豆明珠. 通过外源MYB基因的表达提高水稻的抗逆性[D].济南：山东师范大学， 2017.

[3] 蔡晓锋， 胡体旭， 叶杰，等. 植物盐胁迫抗性的分子机制研究进展[J]. 华中农业大学学报， 2015， 34（3）：134-141.

[4] 陳儒钢， 巩振辉， 逯明辉，等. 植物抗逆反应中的转录因子网络研究进展[J]. 农业生物技术学报， 2010， 18（1）：126-134.

[5] Cui F， Sui N， Duan G， et al. Identification of metabolites and transcripts involved in salt stress and recovery in peanut[J]. Frontiers in Plant Science， 2018， 9：217.

[6] 武晓亮. 花生ABA途径抗逆基因AhLOS5克隆与抗逆性研究[D]. 泰安：山东农业大学， 2017.

[7] 裴翠明， 张振亚， 马进. 南方型紫花苜蓿叶片盐胁迫应答转录因子鉴定与分析[J]. 浙江农业学报， 2016， 28（4）：550-557.

[8] 左照江， 张汝民， 高岩. 盐胁迫下植物细胞离子流变化的研究进展[J]. 浙江农林大学学报，2014，31（5）：805-811.