张晓红，高晋华，范轩坤，陈婉珊，李瑞梅

（太原师范学院生物系，山西 太 原 030031）

丁草胺又称去草胺、马歇特、灭草特，可抑制和破坏禾本科杂草幼根蛋白质的合成而除草，应用广泛，现已成为中国三大除草剂之一[1]，2015年丁草胺使用量约占除草剂用量的50%～60%[2]。除草剂随雨水冲刷最终释放到水环境，美国明尼苏达州地表水中发现乙草胺残留浓度为1.2～2.5 μg/L[3]，菲律宾湖泊和河流中丁草胺残留浓度达1.9～5.1 ng/L、地表水中达0.163 ng/L，而中国稻田水中达0.56～1.07 mg/L[4]，在一些工业区的土壤中含量超过国家标准数倍[5]。环境中残留的丁草胺会对水生生物造成危害。组织病理学研究发现丁草胺对鱼类有较高毒性，使鱼鳃、肝胰脏和肾脏细胞水肿甚至中度坏死[6]， 染色体发生畸变[7]，影响斑马鱼胚胎发育、生殖能力及性激素和甲状腺激素的产生[8-9]等。

酯酶(esterase，EST)同工酶在酯代谢和生物膜的结构等方面发挥作用，能催化酯键水解，属于水解酶类[10]，具有解毒作用，可水解大量外源酯类化合物。过氧化物酶(peroxidase，POD)同工酶能利用H2O2氧化供氢体，反映生物体产生和消除自由基的能力[11]及体内代谢状况，对逆境反应敏感，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用。研究表明除草剂百草枯、2，4-D丁酯、丁草胺均对金鱼血清酯酶、过氧化物酶同工酶具有一定影响[12-13]，而对金鱼组织器官同工酶影响的研究还未见报道。因此，本文通过检测市售60%丁草胺乳油对金鱼(Carassius auratus)主要器官EST、POD同工酶的影响，探讨丁草胺的环境风险，为丁草胺对人类健康影响的研究提供基础依据，为农田、水域丁草胺使用量、残留提供参考。

1 材料与方法

1.1 研究对象和受试物

金鱼体质量(4.5±0.5) g，体长(5.5±0.5) cm，购于太原市花鸟鱼虫市场。丁草胺乳油(有效成分含量60%)购自太原市顺登农业科技发展公司。丁草胺，CAS23184-66-9，分子式C17H26ClN O2，熔点＜-5 ℃，沸点156 ℃，相对密度1.06～1.07(25 ℃)，分解温度165℃，闪点100 ℃。原药纯品为100 μg/mL淡黄色油状液体，能溶于丙酮、乙醇、甲醇、苯等多种有机溶剂，在水中溶解度为2 mg/L。抗光性良好，275 ℃开始热分解，pH值4以下不稳定。商业剂型为60%乳油或5%颗粒剂。

1.2 急性染毒

丁草胺(60%乳液)对金鱼染毒24 h的半数致死浓度(lethal concentration 50，LC)为1.31 mL/L[12]，据此配制

50 0.4、0.8、1.2 mL/L浓度组，设0.9%生理盐水为对照组，每组选取金鱼5尾，按0.1 mL/g的剂量腹腔注射，24 h后进行检测，试验期间不投饵。实验重复3次。

1.3 酶活性测定

染毒24 h后，立即将金鱼取出，纱布擦干，断尾，血止后，冰上取心脏、肝胰脏、鳃、肾脏，并立即置于含有生理盐水的平底试管中(每条鱼的相同组织取量相当)，冰上捣碎，高速冷冻匀浆机匀浆，取上清，分装于离心管中，1 500 r/min冷冻(4 ℃)离心20 min，取上清，按2∶1的比例(V/V)加入40%甘油和0.1%溴酚蓝指示剂。采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测酶活性。POD同工酶用联苯胺染色，EST同工酶参照Shaw和Prasad[13]的方法染色，拍照。

1.4 统计分析

采用Gel-Pro analyzer凝胶图像分析软件计算酶带积分光密度(integrated optical density，IOD)值，分析迁移率(migration rate，Rf)。Rf=样品移动的距离/溴酚蓝移动的距离。以SPSS 18.0软件，采用One-Way ANOVA进行方差分析，Duncan Multiple Range test进行校正。以α=0.05为检验水准。

2 结果

2.1 丁草胺对金鱼心脏、肝胰脏、鳃、肾脏EST同工酶的影响

对照组与丁草胺0.4 mL/L组金鱼心脏EST同工酶不表达(图1A、表1)，浓度为0.8 mL/L时出现Rf 0.200(迁移率为0.200)的新条带，活性IOD值为7.0(图1C)；浓度为1.2 mL/L时活性增加了3倍，达20.8，且各浓度组间差异显著(P＜0.05)，同时增加Rf 0.275和Rf 0.487的2条新条带，活性分别为13.8和22.4，与对照组相比差异显著(P＜0.01)， 0.8 mL/L与 1.2 mL/L浓 度 组 间 差 异 显 著(P＜0.05)。

金鱼肝胰脏EST同工酶在对照组有Rf 0.237、0.325和0.563共3条条带，活性均较强，IOD值分别为76.5、 60.2、 96.7(图 1B、 1D)。 随 丁 草 胺 浓 度 增 加(0.4、 0.8、 1.2 mL/L)， 3条 条 带 活 性 分 别 由 46.5、29.2、69.9减弱到9.8、8.9、31.1，两者呈负相关(相关系数r值和P值分别为r=-0.992，P=0.008；r=-0.955，P=0.045；r=-0.984，P=0.016)，各浓度组与对照组相比差异均具有统计学意义(P＜0.01)，各浓度组间条带差异亦有统计学意义(P＜0.05)。

对照组金鱼鳃EST同工酶有Rf 0.429条带，活性微弱，IOD值为12.0(图1C、1G)，丁草胺0.4 mL/L时活性升高为20.2，显著高于对照组(P＜0.01)，0.8 mL/L时活性消失，1.2 mL/L时活性恢复至对照水平，各浓度组间差异显著(P＜0.05)。

对照组金鱼肾脏EST同工酶有Rf 0.438条带，极微弱表达，IOD值为10.7(图1D、1H)，丁草胺0.4 mL/L时活性升高为27.9，显著高于对照组(P＜0.01)；0.8和1.2 mL/L时活性消失，且与0.4 mL/L间差异显著(P＜0.05)。

表1 丁草胺染毒后金鱼EST同工酶的IOD(-x±s，n=3)

2.2 丁草胺对金鱼心脏、肝胰脏、鳃、肾脏POD同工酶的影响

对照组和丁草胺0.4 mL/L、0.8 mL/L时，金鱼心脏POD同工酶不表达(图2A，表2)。1.2 mL/L时出现Rf 0.113新条带，IOD值为50.3，活性显著高于对照组(P＜0.01)，与0.4和0.8 mL/L浓度组间差异显著(P＜0.05)。

对照组金鱼肝胰脏POD同工酶Rf 0.100条带IOD值为53.2(图2B、2D)，随丁草胺浓度增加，活性先升高后降低(72.0、83.9、25.2)，0.8和1.2 mL/L浓度组与对照组相比差异显著(P＜0.01)。各浓度组间差异显著(P＜0.05)。

图2 丁草胺对金鱼POD同工酶活性的影响

表2 丁草胺染毒后金鱼POD同工酶的IOD(-x±s，n=3)

对照组金鱼鳃POD同工酶Rf 0.185条带IOD值为39.9(图2C、2G)，丁草胺0.4 mL/L时活性升高为55.5，0.8 mL/L时消失，1.2 mL/L时活性急剧升高为65.3，与对照组差异显著(P＜0.05)，0.8 mL/L与其他浓度组间差异显著(P＜0.05)。

对照组金鱼肾脏POD同工酶Rf 0.343活性较强(IOD值73.9)(图2D、2H)，丁草胺0.4和0.8 mL/L时活性消失，1.2 mL/L时IOD值为57.6，显著低于对照组(P＜0.01)。1.2 mL/L与其他浓度组间差异显著(P＜0.05)。

3 讨论

丁草胺低浓度(0.4 mL/L)时，供应心脑的血液中外源丁草胺，经肝胰脏、血清[12]、鳃、肾脏EST同工酶的应急解毒后已极微量，因而心脏EST同工酶与对照组均无表达，丁草胺中浓度(0.8 mL/L)时金鱼心脏EST同工酶出现1条新条带，活性是对照组的7倍，而在接近半数致死浓度(1.2 mL/L)时EST同工酶表型复杂，活性极强，达到对照组的50多倍，说明心脏在丁草胺中、高浓度时发生应激反应，这与Xiang等[14]丁草胺对斑马鱼丙二醛(MDA)的毒性结果类似。低浓度(0.4 mL/L)时鳃、肾脏EST同工酶活性分别升高2倍、3倍，说明低浓度时丁草胺诱导鳃、肾脏EST同工酶活性，增强其解毒功能；肝胰脏EST同工酶具3条极强活性条带，说明肝胰脏EST同工酶在酯类代谢中发挥着重要作用，随丁草胺浓度增加肝胰脏EST同工酶活性逐渐降低，说明丁草胺对金鱼肝胰脏EST同工酶活性具有极强的抑制作用。丁草胺中浓度(0.8 mL/L)时血清、鳃、肾脏EST同工酶活性降低或消失，可能是丁草胺抑制其合成或破坏其结构。高浓度(1.2 mL/L)时血液、鳃、肾脏及心脏EST同工酶活性急剧增强，可能是EST同工酶失去保护血细胞、鳃、肾脏及心脏细胞膜结构功能，细胞膜通透性改变，而使胞内被诱导的EST同工酶迅急大量释放，以增强应急解毒功能，研究表明单酰基甘油酯酶(MAGL)作为水解酶，在肿瘤细胞中高表达，促进肿瘤的发生、转移、侵袭、存活以及在体内生长[15]，丁草胺对酯酶家族成员的作用还有待进一步研究。

丁草胺高浓度(1.2 mL/L)时金鱼心脏POD同工酶出现1条新条带，酶活性是对照组的50倍，说明高浓度时金鱼心脏POD同工酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)抗氧化防御极强[16]，对丁草胺反应灵敏，结果与EST同工酶类似。

对照组肾脏POD同工酶活性极强，说明其在肾脏解毒过程中发挥重要作用。丁草胺低浓度(0.4 mL/L)时肾脏POD同工酶即消失，说明丁草胺对肾脏POD同工酶抑制作用最强，鳃、肝胰脏POD同工酶活性增强，说明鳃、肝胰脏对丁草胺的抗氧化能力强于肾脏、心脏。鳃、肾脏、肝胰脏POD同工酶活性变化与EST同工酶类似。

随丁草胺浓度增加鳃POD同工酶活性升高、消失后又增强，肾脏POD同工酶活性消失后活性较对照组下降、肝胰脏POD同工酶活性升高后降低，结果与丁草胺使斑马鱼活性氧(ROS)下降[14]，肝胰脏SOD、谷胱甘肽S转移酶(GST)酶活性下降[16]一致，反映POD同工酶高度的组织特异性，不同物种不同抗氧化酶对外源丁草胺抗氧化存在差异。POD同工酶中的过氧化物酶1具有抗氧化作用[17]，且在肝癌形成和恶性进展中发挥一定作用[18]，参与肝癌发生进展调控，在肝癌转化细胞中表达升高，与凋亡抑制，肿瘤存活率增加有关，丁草胺与癌细胞的发生是否存在一定关系，仍需深入研究。

综上所述，丁草胺对金鱼不同组织器官EST、POD同工酶影响不同。丁草胺抑制金鱼肝胰脏EST、肾脏POD同工酶活性，中浓度(0.8 mL/L)及以上丁草胺破坏鳃、肾脏EST、POD同工酶活性。60%乳油型丁草胺主要由丁草胺原药和其他成分混制而成。酶活性的变化，是丁草胺的单独作用还是复杂成分之间的协同作用仍有待进一步研究。