王 婧， 李 沅， 刘 冉， 高 子 晴

( 1.大连工业大学 生物工程学院， 辽宁 大连 116034；2.大连工业大学 轻工与化学工程学院， 辽宁 大连 116034 )

0 引 言

我国是茶叶消耗大国，随着茶叶深加工领域不断发展，茶产品产量迅速增长，作为茶饮料的副产品，茶渣的年产量随之迅速增加[1]。茶渣本身富含营养物质，直接废弃造成了资源浪费[2]。目前，茶渣的处理主要有两种，一种是代替谷物等传统原料制成动物饲料[3]，另一种是做成肥料[4]。由于茶渣中含有高浓度的咖啡因[5]，动物食用会导致其畜产品产量减少，用作土地肥料导致盐碱化，影响种子萌发和作物生长。因此，快速有效地降解咖啡因成为茶渣利用技术的关键[6-7]。与化学和物理法去除咖啡因相比，微生物法具有操作简单、去除率高、无毒无污染而且成本低廉等优点，越来越受到人们的关注[8]。

本试验从茶园土壤中筛选纯化得到一株咖啡因高效降解菌株，对其进行鉴定，并对咖啡因降解条件进行优化，确定茶渣降解的最优条件，以期为微生物降解咖啡因的机理提供一定的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试土壤采自江苏省镇江市五女峰茶园(N32°19′64.58″，E119°25′10.34″)。

M9培养基：咖啡因0.15%，Na2HPO4·12H2O 6.4%，KH2PO41.5%，NH4Cl 0.5%，NaCl 0.25%，pH 5.0，121 ℃湿热灭菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 咖啡因降解菌的分离与纯化

称取土壤样品1 g放于50 mL含0.3 g/L咖啡因的M9培养基中，30 ℃、180 r/min培养72 h[9]。于4 000 r/min离心20 min，取上清液2.5 mL至于50 mL M9培养基。转接3代后，将菌液进行稀释涂布，待平板上出现单菌落后，挑取单菌落反复划线进行纯化。将纯化后的菌株接种于含1.5 g/L咖啡因的M9培养基中，培养72 h后，利用HPLC法[10]测定上清液剩余咖啡因的量，计算各菌株咖啡因的降解率，筛选出降解能力最强的菌株。

1.2.2 菌种的鉴定

用试剂盒快速提取基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板，16S rRNA 的通用引物(正向27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′，反向1 492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)进行PCR扩增。 PCR体系(50 μL)：0.05 U/μL TakaRa Taq 0.6 μL，10×PCR Buffer(Mg2+) 5 μL，40 mmol/L dNTPs 4 μL，基因组DNA模板2 μL，10 μmmol/L正反向引物各1 μL，ddH2O 36.4 μL。PCR条件：94 ℃ 4 min；94 ℃ 50 s，52 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，循环29次；72 ℃10 min；16 ℃恒温。PCR产物的纯化和测序由宝生物工程(大连)有限公司完成，将测序结果在GenBank进行序列比对及同源分析[11]。

1.2.3 HPLC法测定咖啡因含量

样品预处理：待测样品经过10 000 r/min、4 ℃ 离心10 min后，取上清于4 ℃保存备用[12]。

HPLC检测条件：色谱柱，Hypersil C-18柱(φ4.6 mm×250 mm，5 μm)；紫外检测波长254 nm；流动相：甲醇与水体积比30∶70；体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃。

1.2.4 不同培养条件对菌株的影响

分别选取pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，温度20、25、30、35、40 ℃、摇床转速140、160、180、200、220 r/min、接种量1%、3%、5%、7%、9%，以不加对应因子的试验组为空白对照，培养36 h后进行测定[13]。

1.2.5 菌株对茶渣中咖啡因的降解

将含有1.5 g/L咖啡因的M9培养基培养24 h 的菌株作为种子液，分别装入9个含有100 mL 茶渣培养基的锥形瓶。分别加入无菌水，并接种5 mL种子液，将锥形瓶放入不同温度的恒温培养箱中，待发酵到指定的时间后，取出检测。

2 结果与讨论

2.1 咖啡因降解菌的筛选及鉴定

经分离和纯化，得到一株咖啡因高效降解菌，命名为CF1。当咖啡因质量浓度为1.5 g/L时，24 h菌株降解率达到了53.1%。菌株在LB平板上的菌落呈白色，圆形，凸起，表面润泽，边缘整齐，显微镜下细胞形态为杆状，革兰氏染色阴性。菌株CF1的16S rRNA序列长度为1 493 bp，通过 BLAST序列同源性分析，菌株CF1与BurkholderiasediminicolaHU2-65W最为相似，相似度为98.4%。根据16S rRNA基因序列构建系统发育树，如图1所示。CF1与B.sediminicolaHU2-65W和BurkholderiaaspalathiVGIC在同一分枝上。经形态学和16S rRNA 基因测序与系统发育树构建，菌株CF1属于Burkholderia属。

2.2 降解条件对菌种生长和咖啡因降解率的影响

如图2所示，CF1在pH 5.0～6.0生长状况良好，对咖啡因降解能力最强；低于4.0或高于7.0，菌体生长能力弱，咖啡因降解能力也较低，因此确定CF1降解咖啡因的最适pH为5.0。菌株生长与咖啡因降解呈正相关。

如图3所示，在20～30 ℃时，CF1菌体浓度和咖啡因降解率随温度的升高而增加；30～35 ℃时，菌体的OD最大，但菌浓度变化不大，培养基内的咖啡因降解完全，这是菌体生长及咖啡因降解的最适温度范围；40 ℃时，菌体几乎停止生长，咖啡因降解率为0。因此确定菌株CF1咖啡因降解的最适温度为30 ℃。

如图4所示，当转速小于180 r/min时，随着转速的增加，CF1的生长速率和对咖啡因的降解率有小幅度提高；但当转速大于180 r/min后，其对菌株生长及咖啡因降解率影响不明显。因此确定最适转速为180 r/min。

图1 菌株CF1的系统发育树Fig.1 The phylogenetic tree of strain CF1

图2 pH对菌株CF1生长及咖啡因降解率的影响Fig.2 Effects of pH on CF1 growth and caffeine degradation

图3 温度对菌株CF1生长及咖啡因降解率的影响Fig.3 Effects of temperature on CF1 growth and caffeine degradation

图4 转速对菌株CF1生长及咖啡因降解率的影响Fig.4 Effects of rotation rate on CF1 growth and caffeine degradation

如图5所示，当接种量大于3%时，其对CF1的生长及咖啡因降解影响不显著。因此选择最适接种量为5%。

图5 接种量对菌株CF1生长及咖啡因降解率的影响
Fig.5 Effects of inoculation amount on CF1 growth and caffeine degradation

2.3 咖啡因降解条件的优化

通过正交试验设计方法优化菌株对茶渣中咖啡因的降解，选取含水量、温度、发酵时间3个因素，每个因素设3个水平进行分析，选取L9(34)正交设计表的前3列进行试验，共进行9次试验。正交试验因素及水平见表1，方案及结果见表2。

由表2可以看出，正交设计的最优组合是A1B2C2，即降解的最优条件为含水量15 mL，温度30 ℃，降解时间7 d，茶渣中咖啡因的降解率最高达到98.1%。

表1 正交试验因素和水平Tab.1 The factors and levels of orthogonal test

表2 正交设计方案及结果Tab.2 The scheme and result of orthogonal design

由表3可以看出，温度属于一般显著因素，含水量和时间为不显著因素。茶渣的降解程度与时间成正比，时间因素不显著的原因可能是选取的时间是茶渣降解后期，最少时间5 d时，茶渣的降解水平已经达到较高水平，因此正交试验结果时间不是显著因素。

表3 正交试验结果方差分析Tab.3 The variance analysis of the orthogonal experiment results

3 结 论

从茶园土壤中筛选出1株咖啡因高效降解菌株，该菌株为Burkholderia属，与B.sediminicolaHU2-65W和B.aspalathiVGIC的亲缘关系最近。咖啡因降解菌CF1在M9培养基中的最优生长及降解条件为pH 5.0、30 ℃、摇床转速180 r/min 及接种量5%，其咖啡因的降解能力与菌株的生长在一定范围内成正比。正交试验得到最佳发酵条件为温度30 ℃、时间7 d、茶渣含水量75%，此时茶渣中咖啡因降解效果最佳。将其应用于工业生产，可以有效去除茶渣中的咖啡因，生产出脱咖啡因饲料或肥料，对解决茶渣污染问题有重要意义。