王根红，张志忠

（合肥野生动物园，安徽 合肥 230036）

隐孢子虫（Cryptosporidium）是一种人畜均可感染的肠道寄生虫，主要传播途径为经粪—口传播[1]，能够引起动物及人以严重腹泻为主要临床表现的隐孢子虫病[2]。 隐孢子虫病（cryptosporidiosis）是由1种或多种隐孢子虫感染家畜、野生动物、伴侣动物及人类所引起的一种人畜共患原虫病[3]。其主要危害免疫力低下的人和动物，对幼龄动物的危害较大。人和动物感染后往往出现严重腹泻，甚至危及生命[4]，且目前尚未出现特效治疗方法[5]。调查研究显示，隐孢子虫病能感染幼年动物，临床主要表现为消化道和呼吸道症状。而成年动物感染隐孢子虫病，多无临床症状出现或表现为自限性腹泻[6]。隐孢子虫病呈全球性分布，在我国绝大多数省份均已报道过伴侣动物、家畜及禽鸟类等可与人类密切接触的动物感染隐孢子虫的实例，而关于野生动物隐孢子虫病的报道则极少[7-8]。隐孢子虫虫体是由Tyzzer于1907年在小鼠胃腺细胞中首次发现的[8-9]，目前，研究者已在人畜体内发现的有效虫种有30种，基因型有70余种[10-13]，但仍有些未得到确认。其中，被认定为人畜共患的隐孢子虫包括微小隐孢子虫（C.parvum）、人隐孢子虫（C.hominis）、安氏隐孢子虫（C.andersoni）、贝氏隐孢子虫（C.baileyi）、猫隐孢子虫（C.felis）、犬隐孢子虫（C.canis）、小鼠隐孢子虫（C.muris）、火鸡隐孢子虫（C.meleagridis）、牛隐孢子虫（C.bovis）等。野生动物也可感染隐孢子虫病。在动物园中人与野生动物可以密切接触，因此，对野生动物隐孢子虫感染的调查具有很重要的公共卫生意义。

为了解合肥野生动物园灵长类野生动物隐孢子虫感染情况，该调查采用饱和蔗糖水漂浮法浓集卵囊，利用抗酸染色法进行形态学鉴定，并采用PCR试验和琼脂糖凝胶电泳试验进行验证。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 粪样来源：于安徽省合肥市野生动物园采集灵长类动物（动物种类包括环尾狐猴、赤猴、狒狒、白额卷尾猴、绿猴和金丝猴）排泄的异常粪便。将新鲜粪便装入无菌密封袋中，编号并记录动物的物种名称，保存于安徽农业大学动物科技学院寄生虫教研室的4℃冰箱中。共采集粪样24份。

1.1.2 主要试剂：0.4%NaOH溶液（4 g NaOH，1 000 mL蒸馏水）；饱和蔗糖水溶液；抗酸染液：抗酸Ⅰ液，抗酸Ⅱ液（浓硫酸10 mL，蒸馏水90 mL），抗酸Ⅲ液（孔雀蓝2 g，蒸馏水100 mL）；DNA提取试剂盒购自Omega公司；rTaq酶购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 饱和蔗糖水漂浮法：取适量动物粪便样本2 g，放入0.4%的氢氧化钠溶液中洗涤（去除糖分）后，转移至洁净的烧杯中，加清水并用竹筷将其充分压碎搅拌均匀，分别经过60目和260目的筛子过筛，再加入适量清水稀释，静置1 h后，弃去上清液，保留沉淀。将上述沉淀均分转移至2只离心管中，放入离心机3 000 r/min，离心10 min，注意在放入离心机之前用天平进行配平。弃去上清液，用PBS缓冲液（pH值为7.2）洗涤3次。在离心管中加入沉淀体积5倍的饱和蔗糖水溶液，振荡均匀，用天平进行配平，放入离心机中，转速800 r/min，离心8 min。用铁丝圈蘸取表面液膜，轻轻地抖落至载玻片上，盖好盖玻片，镜检。

1.2.2 抗酸染色法：取离心沉淀后的粪便少许，在载玻片上涂成粪膜，干燥后进行染色，滴加抗酸Ⅰ液数滴作用12 min，冲洗；滴加抗酸Ⅱ液作用5 min，冲洗，晾干；滴加抗酸Ⅲ液作用 1 min，冲洗，晾干后镜检。

根据镜检观察到的虫卵、卵囊或包囊的形态结构、大小及其染色后颜色等特征，结合形态学相关的资料进行虫种鉴定。

1.2.3 利用PCR技术鉴定隐孢子虫卵囊壁蛋白（COWP）基因：使用OMAGA粪便基因组提取试剂盒提取隐孢子虫COWP基因，具体步骤参照说明书。 反应体系如下：10×Buffer 2.5 μL；dNTP 2 μL；MgCl21.5 μL； 上、 下游引物各 1 μL；rTaq 酶 0.2 μL；DNA 8 μL；ddH2O 8.8 μL。 反应条件：95 ℃预变性5 min；95℃变性45 s；47℃退火30 s；72℃延伸30 s；共35个循环；72℃延伸7 min；4℃保存。采用1%琼脂糖进行电泳，检测PCR扩增产物。

1.2.4 数据统计：采用SPSS 23.0软件对24份待检粪样检测结果进行统计分析。

2 结果

2.1 饱和蔗糖水漂浮法检查结果

对24份粪便样本进行漂浮法浓集后，在白额卷尾猴、赤猴、绿猴粪样中未检出隐孢子虫卵囊。其他灵长类动物粪样均可以检测出隐孢子虫卵囊，其中环尾狐猴1份、狒狒2份、金丝猴1份。其形态均呈近圆形或椭圆形，在400倍显微镜下，随机测量卵囊，其大小平均为 4.66 μm×5.18 μm（见图 1）。

2.2 抗酸检查结果

将粪便样本中的虫卵经抗酸染色后，在油镜下观察，背景为蓝绿色，卵囊呈玫瑰红色且明显折光，而囊壁不着色，外圈似有光晕圈，隐约可见内部子孢子和颗粒残体（见图2）。根据卵囊染色后颜色、形态结构及大小，可初步判定为隐孢子虫虫卵。

2.3 PCR的扩增结果

经PCR扩增后，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定可发现目的条带，大小为377 bp（见图3），与预期结果相一致。

2.4 灵长类隐孢子虫感染率统计结果

采集的24份灵长类动物粪样中共有4份样品为隐孢子虫阳性，感染动物分别为环尾狐猴（25%）、狒狒（50%）、金丝猴（25%），总感染率为16.67%（见表1）；而白额卷尾猴、赤猴和绿猴粪便样本中未检出隐孢子虫虫卵。

3 讨论

图1 狒狒粪便样本中的隐孢子虫卵囊

图2 抗酸染色后的隐孢子虫卵囊（×1 000）

动物园中的野生动物能够和人亲密接触，且隐孢子虫病是可广泛引起人和动物腹泻的人畜共患性疾病，极大地威胁了饲养员和游客的健康问题。据观察，游客中低龄儿童和幼儿人数占了极大比重，而研究表明隐孢子虫对免疫力低下的婴幼儿感染率较高，危害较大，往往会导致更严重的腹泻甚至危及生命。隐孢子虫是一种机会性肠道病原体，也是艾滋病人最常见的继发感染病原之一[4]。动物隐孢子虫病的防控方法主要是保持动物生活环境的清洁，注意饮食、饮水的卫生情况和有效处理粪便。该次调查在合肥野生动物园灵长类动物的粪便中发现了隐孢子虫虫卵，证明灵长类野生动物确有隐孢子虫感染，该项调查对公共卫生具有较为重要的意义。

图3 PCR扩增产物

表1 灵长类动物隐孢子虫感染情况

隐孢子虫的传染源为患病动物及向外界排卵囊的人或动物。卵囊可通过经口直接感染方式、间接感染方式和通过饲料、饮水方式传播，也可经空气传播[9]。隐孢子虫的宿主范围非常广，人、家畜、鸟类、爬行动物以及野生动物普遍易感。Muriuki等[11]运用改良抗酸染色方法对肯尼亚地区包括51只黑毛猴和63只橄榄狒狒共114只非人类灵长类动物进行隐孢子虫感染情况的检测，结果显示其阳性率高达51.7%。Lim等[13]对马来西亚地区灵长类动物隐孢子虫感染情况进行了调查，在99份粪便中共有14份呈隐孢子虫阳性，其感染率约为14.1%。而该次采用PCR技术对合肥野生动物园灵长类动物24份粪样调查显示，该园隐孢子虫检出率为16.67%，这与Lim等相关报道较为一致。

由此可见，动物园存在灵长类动物感染隐孢子虫的情况，因此，对动物园饲养的灵长动物进行常规的隐孢子虫感染情况监测是必不可少的，有助于预防和控制隐孢子虫病的传播。