王 淼，母润红，李明成，李洪杰

(1.北华大学医学检验学院免疫教研室，吉林 吉林 132013; 2.北华大学基础医学院免疫教研室，吉林 吉林 132013)

胃癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁人类健康。中国是胃癌高发国家，胃癌发病率和死亡率均高于全球平均水平，在全球居第4位。目前，胃癌可通过放化疗等多种方式治疗，但缺少对早期胃癌的筛查及诊断，大多数胃癌患者确诊时己进入进展期，导致术后出现复发或丧失了手术的最佳机会[1-2]。随着分子生物学技术的发展，从分子水平研究胃癌的发病原因，寻找胃癌进展的基因将对胃癌的综合治疗有重要的意义[3-4]。肿瘤的发生发展并非单基因和单因素过程，而是多基因和多因素的复杂过程，抑制其基因的表达，可控制肿瘤的发生[4]。RNA干扰(RNA interference,RNAi)是进行靶基因表达抑制的核酸操作技术，现已成为研究肿瘤基因治疗的有效工具[5-6]。survivin基因是凋亡抑制蛋白(inhibitors of apoptosis protein,IAP)家族新成员之一，由于其仅在肿瘤和胚胎细胞中特异表达，因而成为肿瘤基因治疗的特异性靶点。国内外研究[7-8]表明：靶向沉默survivin基因的表达能抑制多种肿瘤细胞增殖并促进其凋亡。缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1α,HIF-1α)是普遍存在于实体瘤组织中,抑制其表达对抑制肿瘤的发生发展也可能有重要的临床指导意义[9]。本研究采用RNAi技术沉默胃癌BGC-823细胞中survivin和HIF-1α双基因的表达，观察其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响，为胃癌早期诊断和治疗提供新思路。

1 材料与方法

1.1 细胞、试剂和主要仪器 人胃癌BGC-823细胞(北华大学药学院药理实验室保存)，DMEM培养液和胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，真核转染试剂HifectinⅡ(北京普利莱基因技术有限公司)，TRIzol试剂和AnnexinⅤ/PI双染试剂盒(美国Invitrogen公司)，逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(日本TaKaRa公司)，RIPA裂解液、兔抗人survivin和HIF-1α多克隆抗体及BCA蛋白浓度测定试剂盒(武汉博士德公司)，台盼蓝(美国Sigma公司)，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG 抗体(北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2 小干扰RNA(siRNA)设计策略 根据siRNA设计原则，从GenBank数据库选择survivin和HIF-1α的mRNA序列(NM_001168.2；NM_001012270.1；NM_001012271.1；XR_243654.2)基因信息，确定符合siRNA特征的靶序列，分别命名为siRNA-survivin和siRNA-HIF-1α，同时合成错义RNA(scramble RNA,SCR)作为阴性对照(表1)。此外，设计荧光标记的无靶向siRNA(FAM-siRNA)用于测定siRNA的细胞转染效率。siRNA合成和构建由上海吉玛生物技术制药公司完成。

1.3 人胃癌BGC-823细胞培养和转染 人胃癌BGC-823细胞用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，置于37℃、5% CO2、饱和湿度的恒温培养箱中培养。每48 h传代1次，取生长状态良好的BGC-823细胞，以每孔1.2×105个细胞接种于6孔培养板中，24 h后待细胞铺满每孔约80%，将培养液换为无血清培养基，细胞转染整个步骤完全按照HifectinⅡ真核转染试剂提供的说明书操作。转染siRNA-survivin、siRNA-HIF-1α和 SCR的各组细胞分别命名为sis组、siH组和非靶向特异性组(SCR组)，同时设空白对照组(无血清培养基)。转染效率=荧光阳性细胞数/筛选细胞总数×100%。

表1 人survivin和HIF-1α基因特异性干扰序列

1.4 RT-PCR法检测细胞中survivin和HIF-1α mRNA表达水平 用TRIzol试剂提取sis组、siH组、SCR组和空白对照组BGC-823细胞的总RNA,经紫外分光仪测定RNA的浓度及纯度。凝胶电泳观察RNA的完整性。应用RT-PCR试剂盒逆转录为cDNA，以cDNA为模版，进行RCR扩增，检测各组细胞中survivin和HIF-1α mRNA表达情况。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外成像仪中应用Tanon2500 Gel Imaging system 软件获取图像，以GADPH作为内参，根据2-△△Ct法计算mRNA表达水平，每组实验重复3次，取平均值。

1.5 MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期BGC-823细胞接种于96孔板中，接种细胞数每孔3×103个，体积100 μL，每组设6复孔，终浓度均为100 nmol·L-1。实验分为单干扰组(survivin-siRNA,sis组)、联合干扰组(survivin-siRNA+HIF1α-siRNA,sis+siH组)、非靶向特异性组(SCR组)和空白对照组(无血清培养基)。转染24、48和72 h，终止培养，各孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，继续孵育4 h，弃去上清，各孔加入DMSO 100 μL，继续振摇10 min，充分溶解结晶，于酶标仪上490 nm处测定吸光度[A(490)] 值，以A(490)值代表细胞增殖活性。

1.6 Western blotting 法检测细胞中survivin和HIF-1α蛋白表达水平 分组方法同1.5 。转染后48 h，用试剂盒提取各组BGC-823细胞总蛋白。采用BCA法检测总蛋白浓度。采用SDS-PAGE电泳分离。一抗为兔抗人survivin单克隆抗体(稀释浓度1∶200)、HIF-1α单克隆抗体(稀释浓度1∶300)和GADPH单克隆抗体(稀释浓度1∶500)，4℃过夜。再次用PBST洗膜，加入已稀释的山羊抗兔二抗-HPR(稀释浓度1∶2 000)，置于室温摇床孵育1 h。ECL显影。以各实验组灰度值与对照组灰度值之比表示蛋白相对表达水平。

1.7 流式细胞术检测细胞凋亡率 分组方法同1.5 。转染24 h后细胞用胰酶消化，PBS洗涤2次，制备成细胞悬液，加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 和5 μL PI染液，避光室温孵育10 min，采用流式细胞术检测细胞凋亡情况，结果应用WinMDI 2.9分析软件进行分析。细胞凋亡率=凋亡细胞数/(凋亡细胞数+正常细胞数)×100%。

2 结 果

2.1 siRNA转染胃癌BGC-823细胞效率的鉴定 siRNA成功转染BGC-823细胞6 h后，PBS洗涤3～4次，在激光共聚焦显微镜下观察各组细胞siRNA转染效率。siRNA主要集中在细胞质中，转染成功的细胞有清晰的细胞轮廓，与背景形成明显的反差 (图1，见插页三)。荧光标记siRNA转染细胞效率大于70%,可以完成后续实验。

2.2 各组细胞中survivin 和HIF-1α mRNA表达水平 转染48 h后各组细胞均有亮度相似的GADPH基因条带表达，各组survivin/GADPH比值代表survivin基因的mRNA表达水平(图2)，HIF-1α/GADPH比值代表HIF-1α基因的mRNA表达水平(图3)。与SCR组和空白对照组比较，sis组细胞中survivin mRNA表达水平和siH组细胞中HIF-1α mRNA表达水平明显降低(P<0.05或P<0.01)；SCR组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2和3。

Lane 1: Blank control group; Lane 2:SCR group; Lane 3:Sis group.

图2 转染48 h后各组细胞中survivin mRNA表达电泳图

Fig.2 Electropheregram of expressions of survivin mRNA in cells in various groups 48 h after transfection

Lane 1:Blank control group; Lane 2: SCR group; Lane 3:SiH group.

图3 转染48 h后各组细胞中HIF-1α mRNA表达电泳图

Fig.3 Expression levels of HIF-1α mRNA in cells in various groups 48 h after transfection

表2 转染48 h后各组细胞中survivin mRNA表达水平

GroupSurvivin mRNABlank control 0.927 0±0.021 7SCR 0.947 5±0.032 6Sis 0.457 3±0.021 4∗△

*P<0.01 compared with blank control group；△P<0.01 compared with SCR group.

2.3 各组细胞增殖活性 与空白对照组比较,SCR组细胞增殖活性无明显变化(P>0.05),sis组和sis+siH组细胞增殖活性明显降低(P<0.05)，生长曲线低平，且sis+siH组细胞增殖活性明显低于sis组(P<0.05)。见图4和表4。

2.4 各组细胞中surviving和HIF-1α蛋白表达水平 与空白对照组比较， sis组surviving蛋白表达水平、sis+siH组surviving和HIF-1α蛋白表达水平明显降低(P<0.05)；SCR组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5和表5。

表3 转染48 h后各组细胞中HIF-1α mRNA表达水平

GroupHIF-1α mRNABlank control 0.826 3±0.032 6SCR 0.832 4±0.012 7SiH 0.351 6±0.011 6∗△

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with SCR group.

图4 转染不同时间各组BGC-823细胞增殖活性

Fig.4 Proliferation activities of BGC-823 cells in various groups at different time after transfection

表4 各组BGC-823细胞增殖活性

Group A(490)(t/h) 2448 72Blank control0.867 6±0.041 41.241 0±0.084 1 1.928 0±0.077 9SCR0.934 1±0.052 51.278 0±0.069 0 2.004 0±0.095 0Sis0.418 2±0.044 3∗0.579 0±0.034 0∗ 1.349 0±0.156 5∗Sis+siH0.313 7±0.032 2∗△0.467 5±0.055 1∗△ 0.941 0±0.096 1∗△

*P<0.05 compared with blank control group；△P<0.05 compared with sis group.

2.5 各组细胞凋亡率 转染48 h后，与空白对照组比较，sis组和sis+siH组细胞凋亡率明显升高(F=109,P<0.01)；空白对照组与SCR组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；sis+siH组细胞凋亡率略高于sis组，但组间比较差异也无统计学意义(P>0.05)。见图6和表6。

Lane 1: Blank control group; Lane 2:SCR group; Lane 3:Sis group; Lane 4:Sis+siH group.

图5 各组细胞中survivin和HIF-1α蛋白表达电泳图

Fig.5 Electrophoregram of expressions of survivin and HIF-1α proteins in cells in various groups

表5 各组细胞中survivin和HIF-1α蛋白表达水平

GroupSurvivin proteinHIF-1α proteinBlank control0.67±0.030.73±0.01SCR0.68±0.030.73±0.01Sis 0.20±0.02∗ 0.70±0.02Sis+siH 0.58±0.02∗ 0.31±0.02∗

*P<0.05 compared with blank control group.

3 讨 论

A: Blank control group; B:SCR group; C:Sis group; D:Sis+siH group.

表6 各组细胞凋亡率

GroupApoptotic rateBlank control11.54±2.67SCR13.00±2.32Sis16.70±2.03∗Sis+siH16.74±3.03∗

*P<0.01 compared with blank control group.

研究[10-11]显示：特异性抑制肿瘤细胞中靶向基因的表达，可有效抑制肿瘤细胞的侵袭，发挥肿瘤基因治疗作用。研究[12-14]表明：survivin和HIF-1α在胃癌细胞内均有一定程度的表达，阻断 其表达可抑制肿瘤细胞的生长。国内外学者成功地利用了RNAi技术沉默survivin，可明显抑制胃癌SGC-7901和BGC-823细胞生长增殖[15-17]，本研究结果也证实了该结论。本研究结果显示：转染48 h后，sis组和sis+siH组胃癌BGC-823细胞的生长受到明显抑制，生长曲线低平，且sis+siH组的生长抑制作用明显强于sis组。本研究结果表明：抑制胃癌BGC-823细胞中surviving和HIF-1α基因表达水平可降低胃癌细胞增殖能力。肿瘤细胞生长一方面由细胞周期的细胞数决定，另一方面也取决于细胞增殖与细胞死亡的比例[18-21]。因此，可通过检测surviving和HIF-1α对胃癌BGC-823细胞凋亡的影响，来评价细胞增殖与凋亡之间的关系。本研究结果显示：sis组和sis+siH组胃癌BGC-823细胞凋亡率明显高于空白对照组和SCR组,空白对照组与SCR组间比较无明显差异；sis+siH组细胞凋亡率略高于sis组，但组间比较差异无统计学意义。有研究[18]通过靶向诱导内皮细胞凋亡抑制肿瘤血管新生，结果显示：促凋亡蛋白Bm和Bax表达及细胞色素C(CytC)的释放明显增加，而HIF-1α是血管内皮生长因子C(VEGF-C)的上游基因。本研究将surviving和HIF-1α基因作为靶向沉默基因，主要是利用该基因由线粒体释放入胞浆，通过内源性凋亡途径诱导细胞凋亡。

本研究利用Hifectin Ⅱ真核转染试剂，将预先合成的HIF-1α和survivin 特异性siRNA直接转染胃癌BGC-823细胞，避免了构建表达载体的过程。此外，为便于观察，将荧光标记的无靶向siRNA(FAM-siRNA)一同转染细胞内，用于测定siRNA的细胞转染效率。本研究结果显示：HifectinⅡ作为一种阳离子脂质体转染试剂，与应用最为广泛的Lipo2000比较，具有转化效率高和操作便捷的优点。

综上所述，RNAi沉默survivin和HIF-1α双靶点基因，可抑制胃癌BGC-823细胞增殖，促进其凋亡。本研究结果初步提示：沉默survivin和HIF-1α基因有望成为胃癌基因治疗的新方法，但其具体的分子作用机制仍需进一步研究。