孙思佳，翟 磊，许 玲，于盼盼，白秀彬，姚 粟

（1.中国食品发酵工业研究院有限公司，中国工业微生物菌种保藏中心，北京100015；2.山东扳倒井股份有限公司，山东淄博256300）

芝麻香型白酒是我国传统白酒的创新酒种之一，以其独特的清浓酱融合的生产工艺特点和优雅的芝麻香味而闻名，深受国内外消费者青睐，市场发展前景广阔[1]。芝麻香型白酒的酿造离不开大曲，大曲是白酒酿造的糖化发酵剂，含有多种微生物及生物酶，对白酒品质具有重要影响。然而，目前白酒大曲的生产仍采用自然富集接种的生产方式[2]，受自然环境影响较大，存在大曲原料利用率低、出酒率低、用曲量大、生产成本高等一系列问题。大曲品质与大曲微生物和所产的生物酶系关系密不可分，因此，深入研究大曲中微生物群落结构，掌握微生物菌群变化规律，剖析优势菌群与大曲质量之间的关系，利用微生物强化技术将筛选得到的功能性微生物应用到传统大曲生产制备过程中，对于提高大曲品质具有重要意义。

近年来，不少学者专家开始将筛选得到的高温大曲功能性微生物应用于大曲生产过程，并取得了良好的效果[3-5]。本课题组在扳倒井芝麻香型白酒高温大曲群落结构中发现，大曲发酵前期“上霉”的好坏与成品曲的品质密切相关，影响白酒酿造过程；“上霉”是指大曲发酵前期表面呈现的致密的白色小点，本课题组通过分离鉴定，发现其并非“霉菌”，而为扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera），微生物群落结构分析发现该菌株是扳倒井高温大曲发酵前期的优势菌。扣囊复膜孢酵母（Saccharomycopsis fibuligera）属于复膜孢酵母科（Saccharomycopsidaceae），复膜孢酵母属（Saccharomycopsis），是一类能够产生子囊孢子的二形态酵母[6]；广泛分布于高淀粉含量基质中，能够分泌包括淀粉酶[7]在内的多种水解酶，在酿酒行业极具应用价值[8-9]。目前，包括陈美竹[10]、王晓丹[11]在内,已有不少学者从高温大曲中分离得到过扣囊复膜孢酵母（S.fibuligera），但对于其在强化大曲中的生产应用鲜见报道。

本课题组近年来围绕扣囊复膜孢酵母CICC 33077展开研究，发现该菌株能产生发达菌丝，具有良好的温度、pH值耐受性[12]；同时具有较强的产淀粉酶能力，酶活力达到12000 U/g，且所产淀粉酶在酸性高温条件下能保持70%以上酶活力，适合大曲发酵环境，有强化应用于大曲生产的潜力。因此，本研究采用微生物强化技术，通过表面喷洒和内部混料方式将扣囊复膜孢酵母CICC 33077应用于芝麻香型白酒高温大曲的生产，通过比较强化大曲和对照大曲的感官特性、微生物指标、内部结构、理化性质和发酵酒样来解析扣囊复膜孢酵母CICC 33077在大曲制备过程中发挥的作用，提升芝麻香型白酒高温大曲的品质。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

实验菌株：扣囊复膜孢酵母CICC 33077分离于扳倒井芝麻香型白酒高温大曲，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)。

试剂及耗材：麦芽浸粉琼脂培养基（MEA）、平板计数琼脂培养基（PCA），购自北京陆桥技术有限公司；麦芽浸粉、蛋白胨、大豆蛋白胨，购自北京奥博星生物技术有限责任公司；磷酸氢二钾，购自北京化工厂。液体培养基：麦芽浸粉3.586%，大豆蛋白胨1.216%，蛋白胨1.470%，磷酸氢二钾1.148%，pH 7.0。麸皮固体培养基：麸皮25 g，水含量40%。

糖化液：蔗糖20 g、磷酸铵1.25 g、磷酸二氢钾1.25 g，溶解定容至250 mL。

设备：pH计FE20购于梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；恒温培养箱BHG-8082型购于上海一恒科学仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 扣囊复膜孢酵母CICC 33077菌剂制备

斜面种子的制备：将扣囊复膜孢酵母CICC 33077冻干菌粉接种于MEA培养基中，30℃培养24 h后，取单菌落再次接种于MEA培养基中，30℃培养24 h制备得到斜面种子。

一级种子的制备：取一环试管斜面种子转接到到液体培养基中，以30℃、200 r/min振荡培养24 h进行一级种子的制备，得一级种子液。

二级种子的制备：将一级种子液按10%接种量接入到麸皮固体培养基中，30℃下发酵培养4 d进行二级种子的制备，得到二级种子。

菌剂制备：收集扣囊复膜孢酵母CICC 33077二级种子，通过真空冷冻干燥（12%脱脂牛奶作为保护剂）制备得到扣囊复膜孢酵母CICC 33077菌剂，该菌剂的活菌数达到107～108cfu/g，应用于后续的芝麻香型白酒高温大曲的生产。

1.2.2 扣囊复膜孢酵母CICC 33077在高温大曲生产中的强化

采用微生物强化技术，将扣囊复膜孢酵母CICC 33077应用于芝麻香型高温大曲生产。通过表面喷洒和内部混料的方式对高温大曲进行微生物强化，共制备3房大曲，每房约1800块，分别以表面喷洒方式进行扣囊复膜孢酵母CICC 33077强化；通过内部混料方式进行扣囊复膜孢酵母CICC 33077强化，进行大曲强化的曲房每块大曲加入7～8 mL终浓度为6×105cfu/mL的菌液；不添加扣囊复膜孢酵母CICC 33077菌剂的大曲为对照组。

1.2.3 强化大曲品质特性的测定

扣囊复膜孢酵母在大曲制备的前期是优势菌，能够形成肉眼可见的白色斑点，是高温大曲生产前期的重要指标。根据该菌在高温大曲生产过程中出现的规律，将第一次翻曲（发酵9 d）做为本研究的采样点。为了保证采样的均一性，采用五点法结合四分法进行采样。具体的采样方式：在曲房的四角和中间5个位置各取1块长势良好的高温大曲曲块，混合均匀后，使用四分法进行采样，供后续试验测定使用。

1.2.3.1 强化大曲感官指标评定

对接种扣囊复膜孢酵母CICC 33077的强化大曲与对照大曲进行感官鉴定，并按照扳倒井股份有限公司企业标准《大曲评分标准》（BDJ/JW-WSW-06）中大曲感官指标的评价标准（表1）进行评分。

1.2.3.2 强化大曲微生物指标测定

采用稀释涂布平板法，对强化大曲和对照大曲中的扣囊复膜孢酵母进行计数。通过菌落形态特征观察，挑选乳白色，平伏，质地绒状，具有扣囊复膜孢酵母典型特征的菌落进行计数，并随机挑取4个计数的单菌落，采用多相分类鉴定技术确定其分类学地位。

1.2.3.3 强化大曲内部结构解析

利用扫描电镜对接种扣囊复膜孢酵母CICC 33077的强化大曲和对照大曲的结构进行解析。取10 g高温大曲样品在60℃烘箱中过夜干燥后，制备成2 mm×2 mm×2 mm小曲块后放置在样品台上，利用喷金-离子溅射仪（BAL-TEC SCD005）对固定的样品进行喷金，使用扫描电镜Hitachi SU8010进行高温大曲结构的解析。

1.2.3.4 强化大曲理化指标测定

对强化大曲与对照大曲的水分、酸度、淀粉含量、液化力、糖化力、酯化力[13]以及发酵力进行测定。

发酵力测定：采用CO2失重法；取50 mL糖化液于三角瓶中，用油纸包好瓶口，在恒温水浴内沸腾1 h至糖化液微黄时取出，待冷却至室温（30℃）后加入1 g预测定的大曲试样，称重；将三角瓶置于30℃保温24 h后再次称重，两次称量之差为CO2损失的重量。按照下列公式计算大曲发酵力：

注：1.75系依麦塞尔（MIESSI）氏规定。

依据扳倒井股份有限公司企业标准《大曲评分标准》（BDJ/JW-WSW-06）中大曲理化性质的评价标准（表2）对强化大曲与对照大曲的理化特性评分，并综合高温大曲的感官评价指标和理化指标，对大曲进行评定，给出强化大曲与对照大曲的品质等级。

表1 高温大曲感官鉴定评分标准

表2 高温大曲理化评分标准

1.2.4 强化大曲的发酵实验

将出房后的对照大曲和强化大曲接种到大米发酵液，发酵并蒸馏后进行感官评定。大米发酵液具体制备过程如下：取大米800 g，粉碎，加入4倍水，熬制至完全糊化后加入2倍水，冷却至70℃，加入适量液化酶液化，并利用碘液判断是否液化完全。液化完全的大米发酵液灭菌后，接种对照大曲和强化大曲，于30℃恒温培养箱中发酵7 d。蒸馏发酵结束的发酵醪，并取蒸馏出的50 mL酒液作为最终产品，进行感官评定。

2 结果与分析

2.1 强化大曲感官评价结果

对对照大曲（图1A）、喷洒强化大曲（图1B）及混料强化大曲（图1C）进行观察。对照大曲曲皮已干，曲块表面灰白色，“穿衣”一般，曲皮较薄，有轻微水圈出现；喷洒扣囊复膜孢酵母CICC 33077的大曲曲块表面长满白色菌斑（扣囊复膜孢酵母）且分布均匀，曲皮较薄；内部混料扣囊复膜孢酵母CICC 33077的大曲曲块光面“穿衣”较好且均匀，粗糙面白色菌斑（扣囊复膜孢酵母）较密集，曲皮较薄。综合强化大曲与对照大曲的表面形态（表3），得出结论，经扣囊复膜孢酵母CICC 33077强化的大曲在感官指标方面明显优于对照大曲。

2.2 强化大曲微生物测定结果

强化大曲微生物测定结果表明，挑取的菌落均为扣囊复膜孢酵母，强化大曲中扣囊复膜孢酵母数量显著增加，达到107cfu/g，显著高于对照大曲（表4），结果与感官评价中强化大曲表面白菌斑增多一致。

2.3 强化大曲内部结构解析

利用扫描电镜对接种扣囊复膜孢酵母CICC 33077的强化大曲和对照大曲的内部结构进行解析，结果表明，对照大曲结构致密，淀粉颗粒排列整齐，分布均匀，观察到的微生物和菌丝体数量少（图2中A、D）；而经扣囊复膜孢酵母CICC 33077强化的大曲，无论采用表面喷洒方式还是内部混料方式，大曲结构疏松，淀粉颗粒排列松散，分布不均匀，微生物数量较多，大量菌丝体生长（图2中B、C、E、F）；与微生物测定结果一致。

图1 高温大曲表面形态

扣囊复膜孢酵母CICC 33077能够产生发达菌丝，强化大曲中该菌大量增殖，产生发达的菌丝体支撑起了大曲的整个骨架，致使大曲结构缝隙变大，同时，其产生的淀粉酶水解大曲原料，使淀粉颗粒排列松散，进一步疏松了大曲的质地，这均利于大曲中其他微生物的生长和曲心水分的输送，避免了水圈的生成，与感官评价中对照大曲表面有水圈出现，强化大曲表面无水圈出现的结果一致。

表3 高温大曲感官评价结果

表4 高温大曲中扣囊复膜孢酵母计数结果

2.4 强化大曲理化指标测定结果

大曲理化指标测定结果显示，水分和酸度在强化大曲和对照大曲间无明显变化，而糖化力与液化力显著提高，其中表面喷洒扣囊复膜孢酵母CICC 33077的大曲糖化力和液化力分别为1361 mg·G/g·h和5.6 g淀粉/g·h，分别提高了16.9%和47.3%；内部混料接种扣囊复膜孢酵母CICC 33077的大曲的糖化力和液化力分别为1301 mg·G/g·h和4.6 g淀粉/g·h，分别提高了11.7%和21.1%；均显著高于对照大曲（表5），与扣囊复膜孢酵母CICC 33077淀粉酶活力高的特征一致。同时，强化大曲发酵力分别达到1.38 g/100 g（喷洒大曲）和1.23 g/100 g（混料大曲），高于对照大曲，显示出良好的发酵能力。此外，在对强化大曲淀粉含量的测定中发现，本研究采用传统的酸水解法[14-15]不能反映大曲淀粉含量的真实情况；扣囊复膜孢酵母CICC 33077自身能够分泌淀粉酶水解淀粉，使大曲中还原糖大量增加，以还原糖含量折算成淀粉含量进行表征会对测定结果产生极大干扰，而直接以还原糖含量来表征大曲淀粉含量对本研究来说更具有可信度与说服力。强化大曲的还原糖含量分别为4.40%（喷洒大曲）和3.15%（混料大曲），与对照大曲相比，还原糖含量显著增加（见表5），这说明强化大曲中扣囊复膜孢酵母大量增殖并分泌淀粉酶降解原料，致使淀粉含量减少，还原糖含量增加；与强化大曲微生物指标测定结果和内部结构解析结果具有一致性。

图2 高温大曲内部结构扫描电镜图

表5 高温大曲理化指标测定结果

大曲理化指标测定结果表明，扣囊复膜孢酵母CICC 33077微生物强化技术显著的提高了大曲的淀粉降解能力和发酵能力，这有利于提高原料利用率，增加出酒率。结合感官指标对强化大曲与对照大曲进行综合评定，结果显示，表面喷洒和内部混料接种扣囊复膜孢酵母CICC 33077的强化大曲在得分上均高于对照大曲（见表6），其中喷洒大曲被评定为优级曲，混料大曲被评定为一级曲，对照大曲仅为二级曲；这表明扣囊复膜孢酵母CICC 33077的强化能够改善高温大曲的品质，提高优级曲产率，有利于后续芝麻香型白酒的生产。

表6 高温大曲综合评定结果

2.5 强化大曲发酵实验结果

从色泽、香气和口味三方面对发酵酒液进行综合评定，评定结果显示，强化大曲酿造的酒液色泽透明，香气浓郁，醇甜爽净，香气愉悦程度和酒样干净度均优于对照大曲（表7）。此外，喷洒强化大曲发酵得到的酒液的酒精度为45.2%vol，相较于对照大曲提高了6.4%，混料强化大曲和对照大曲发酵得到的酒液在酒精度上无明显区别。

表7 高温大曲发酵酒样的感官评定

3 讨论

扣囊复膜孢酵母能够分泌淀粉酶[16-17]、蛋白酶[18]及β-葡萄糖苷酶[19]，同时能够产生海藻糖[20]，在食品、发酵、制药及乙醇生产行业均具有很大的应用价值[21-24]。本研究将分离筛选得到的扣囊复膜孢酵母应用于白酒酿造，利用微生物强化技术，通过不同方式将具有较高产淀粉酶活力的菌株扣囊复膜孢酵母CICC 33077添加到芝麻香型白酒高温大曲生产过程中，取得了良好的效果。

扣囊复膜孢酵母CICC 33077具有较强产淀粉酶能力，淀粉酶活力达到12000 U/g，酶最适反应温度为50℃，最适反应pH值为4.0，适合大曲发酵环境。将该菌株应用于大曲生产，显著的提高了大曲原料中淀粉的降解能力，强化大曲糖化力与液化力分别提高了16.9%和47.3%，淀粉降解产物还原糖含量显著增加，大曲原料利用率提高。同时，大曲综合评定结果表明，强化大曲达到优级曲和一级曲水平；发酵酒色泽透明，香气浓郁，醇甜爽净，品质得到极大改善。此外，我们对两种强化方式进行了比较，结果表明喷洒强化方式制备得到的大曲在糖化力、液化力、发酵力、品质等级等方面均优于混料大曲，更加适合应用于高温大曲的生产过程。

本研究首次将扫描电镜技术[25]应用于大曲内部结构的解析，动态监测大曲内部结构变化，再结合大曲微生物指标、感官指标、理化指标的测定，建立了芝麻香型白酒高温大曲动态监测模型，直观地反映了扣囊复膜孢酵母CICC 33077对大曲品质的促进作用。高产淀粉酶菌株扣囊复膜孢酵母CICC 33077的强化能够高效降解大曲中的淀粉颗粒，既能产生大量小分子糖，参与到美拉德反应中，生成白酒风味成分或前体物质，丰富大曲风味，又能使大曲内部缝隙增大，避免曲块板结；同时该菌株产生的发达菌丝体能够进一步疏松大曲结构，重构大曲内部骨架，利于吸收并引导出大曲中心部位的水分，减少大曲“坏心”、胀裂的概率，利于其他微生物的生长繁殖，起到促进大曲微生物群落结构更替的作用。目前，有关扣囊复膜孢酵母对大曲微生物群落结构影响的研究仍在进行中。本研究将扣囊复膜孢酵母CICC 33077实际应用于大曲生产，并通过多种方式对强化大曲进行分析评价，不仅展现了该菌株在酿酒行业的应用潜力，同时发展了大曲评价体系，可为其他优势功能性菌株在高温大曲中的应用起到良好的示范作用。