王媛媛，马素辉，蔡 琼，安丽华，吉成均*

(1 北京大学 城市与环境学院，北京 100871；2 北京大学 医药卫生分析中心，北京 100191)

气孔是植物表面由2个保卫细胞围成的孔隙，在植物体的茎、叶、花、果实和种子等器官的表面均有分布，尤以叶片的上下表面为多[1]。尽管气孔占植物地上器官表面积的比例不到5%，但植物光合作用所需的CO2和蒸腾作用散失的水分大约有70%是通过气孔进出的，气孔在影响全球水和碳循环方面发挥着重要作用[1-2]。如陆生植物通过气孔和角质层的全年蒸腾量约7.0×1016kg，相当于陆地全年降水量的64%；而通过气孔和角质层植物每年可以从大气中固定约1.2×1017g碳[3]。因此，气孔指标的变化将直接影响水分和CO2的交换速率，进而影响植物光合作用和蒸腾作用的效率，以及植物的生长发育和全球碳循环。

作为植物与外界进行水气交换的主要通道，气孔对环境变化较为敏感。前人研究表明：气孔对环境改变的响应策略有长期和短期2种，在短期可通过调控气孔的开张来完成，而长期响应则靠改变气孔大小和气孔密度来实现[2, 4]。关于气孔指标与环境因子的关系，国内外已有大量报道，如气孔指标与水分[5-6]、温度[7-8]、CO2浓度[9-11]和海拔[12-14]之间的关系等，并揭示了气孔指标随环境变化的一般规律[15-16]。

气孔和保卫细胞合称气孔器。根据保卫细胞的形状，种子植物的气孔器可以分为2类：哑铃型气孔器和肾型气孔器[1]。哑铃型气孔器的保卫细胞为哑铃形，主要存在于禾本科和莎草科等单子叶植物中，气孔呈带状分布；而肾型气孔器的保卫细胞呈肾形，存在于双子叶植物和除禾草外的单子叶植物中，气孔多为散生分布[3]。已有的研究表明：哑铃形保卫细胞和肾形保卫细胞的细胞壁微纤丝排列方式不同，哑铃型气孔器和肾型气孔器的发育模式存在明显区别，哑铃型气孔器的进化程度更高[17]。在对环境变化的短期响应方面，哑铃型气孔器的开闭速度更快，更能适应外界环境的变化[3]。那么，在短期响应策略上存在差异的2类气孔器，在气孔密度和气孔大小等表征长期气孔响应策略的指标上是否存在差异？2类气孔器的这些气孔指标与环境因子的关系是否存在差异？

截至目前，学术界对2类气孔器气孔特征的比较研究还比较少，尚不清楚不同保卫细胞形成的气孔与环境的关系是否存在差异，而区域尺度上对2类气孔特征的比较研究也鲜有报道。因此，在区域尺度上研究不同气孔器类型气孔特征对环境因子的长期响应规律，可以探讨气孔短期响应与长期响应策略的权衡关系，深入了解气孔特征对气候变化的适应机制，有助于准确预测未来全球气候变化情景下，陆地生态系统水和碳循环的变化特征。

青藏高原和内蒙古高原草地是中国2种较为典型的草地生态系统，草地植物的种类和数量繁多，分布着大量单子叶植物和双子叶植物。由于地理位置、气候条件的不同，2个地区植物的生长受到不同因素的限制。青藏高原海拔高，并受西南季风控制，环境相对湿润，但生长季温度较低，因而低温是植物生长的主要限制因子；内蒙古高原受温带大陆季风气候影响，环境干旱，生长季温度较高，植物生长主要受到降水的限制[18-19]。2个地区显著的环境差异，为哑铃型气孔器和肾型气孔器的比较研究提供了得天独厚的条件，也为在区域尺度上研究2类气孔器的气孔特征及其对环境因子的响应提供了理想材料。

本研究以青藏高原和内蒙古高原草地常见种或优势种植物的叶片为研究对象，通过比较哑铃型气孔器和肾型气孔器的特征，揭示2类气孔器气孔特征的异同及其对环境因子的响应规律。基于以往的文献分析，在面对外界环境的变化时，气孔对环境的短期响应和长期响应可能相互权衡，互为补充[3]。短期响应较快的植物，长期响应的程度较小，即气孔指标变化较小，与环境因子的关系较弱；反之亦然。故哑铃型和肾型气孔器气孔指标的变化程度和与环境因子的关系可能有所差别。此外，高寒环境会使植物表皮细胞的体积增大[19]，而气孔的大小和数量之间本身存在内部的权衡关系，故2类气孔器的大小和数量在2个地区也可能存在差异。因此，我们提出以下3个科学假设：1)哑铃型气孔器气孔指标的变异系数小于肾型气孔器；2)哑铃型气孔器气孔指标与环境气候指标的关系弱于肾型气孔器；3)两地两类气孔器的气孔指标存在差异，内蒙古高原的气孔长度低于青藏高原，而内蒙古高原的气孔密度高于青藏高原。

1 材料和方法

1.1 研究区域

研究区域为内蒙古高原(107.26～120.06°E，38.41～49.51°N)和青藏高原(80.25～102.89°E，31.10～37.43°N)，包括内蒙古、甘肃、青海和西藏4个省份。内蒙古高原受典型温带大陆性季风的影响，冬季寒冷漫长，夏季温暖干旱，温度自西南向东北呈递减趋势，降水从西南向东北呈递增趋势[20]；研究区域海拔588～1 458 m，年平均温度-2.5～7.9℃，年平均降水量150.2～426.6 mm。青藏高原地区海拔较高，温度较低且季节差异明显，降水主要受西南季风控制，自东南向西北方向逐渐减少，降水的季节分配极不均匀，雨季和旱季差异明显[21]；研究区域海拔2 984～5 249 m，年平均温度-5.2～3.5℃，年平均降水量69.3～624.4 mm。

图1 青藏高原和内蒙古高原草地样地分布图Fig.1 Locations of sites sampled across the grasslands on the Tibetan Plateau and Inner Mongolian Plateau

1.2 采集方法和测量指标

样品采集时间分别为2014和2015年7～8月。选取地势平坦、受人为干扰和放牧影响较小、有代表性的群落类型设置样地。其中，内蒙古高原共设置有114个样地，青藏高原共设置109个样地(图1)。每个样地选取分布较广且具有比较意义的常见种或优势种进行取样，每种植物选取3～5株成熟植株，采集发育程度相近、位置相同的成熟健康叶片，在野外立即用FAA固定液固定，并记录各采集地点的海拔、经纬度和样地信息。

采用指甲油印迹法和铬酸离析法[22]进行制片。指甲油印迹法：在距叶尖约2/3处的叶片下表面均匀涂抹1层指甲油，于室温自然晾干，用透明胶带粘取叶片下表皮印记后粘在载玻片上，制成临时装片。铬酸离析法：将叶片剪下约1 cm小段(均在距叶尖约2/3处)，用10%铬酸溶液(三氧化铬∶水=1∶10)浸泡约16 h，待表皮层与叶肉细胞分开后将表皮展平在滴有蒸馏水的载玻片上，制成临时装片。Motic B5显微成像系统进行拍照及测量。

气孔指标测量方法和计算方法：

1) 气孔长度(SL)。每个样品随机选取10个大小约为0.1 mm2的视野，每个视野随机选取5个气孔，测量组成气孔的2个保卫细胞的长度(μm)。

2) 气孔密度(SD)。每个样品随机选取10个大小约为0.1 mm2的视野，测量视野面积并统计视野内的气孔数量，换算为单位面积的气孔数，即为气孔密度(个·mm-2)。

3) 气孔指数(SI)。每个样品随机选取10个大小约为0.1 mm2的视野，统计视野内的气孔数量和表皮细胞数量，计算气孔指数，计算公式为：

4) SPI指数。近似理解为单位面积内的总气孔面积，计算公式为：

SPI(%)=SL2×SD×10-4

其中SL为气孔长度(μm)，SD为气孔密度(个·mm-2)。

1.3 气候数据来源

研究所用海拔(Elevation)数据来自实测数据，年均温(MAT)和年降水(MAP)数据来自世界气候数据网站(http://www.worldclim.org)，通过克里格插值法获取。

1.4 数据分析

利用t检验分析2类气孔器气孔指标的差异(α= 0.05)，以及内蒙古高原和青藏高原2类气孔器气孔指标的差异(α= 0.05)；利用简单线性回归分析海拔、MAT和MAP对叶片气孔指标的影响；利用多元回归分析海拔、MAT和MAP对叶片气孔指标的解释率。本研究中的统计分析利用SPSS 22.0和Excel 2016软件完成，图表绘制由Sigmaplot 11.0和Excel 2016软件完成。

2 结果与分析

本研究在青藏高原和内蒙古高原的223个样地中共采集草地植物120种，内蒙古高原54种，青藏高原72种，隶属于25个科，60个属，其中2地共有种有6种。采集的草地植物中，具哑铃型气孔器的植物有39种，主要分布于禾本科(Gramineae)和莎草科(Cyperaceae)，具肾型气孔器的植物有81种，以豆科(Fabaceae)和菊科(Asteraceae)最多。由于青藏高原和内蒙古高原6个共有种植物的样地较少，代表性不足。因此，未对2地共有种进行单独的比较分析。

2.1 哑铃型气孔器和肾型气孔器气孔特征的比较

对气孔器的4个气孔指标进行独立样本t检验，在总体水平上，除了气孔密度之外，哑铃型气孔器的气孔长度(t= 30.65,P< 0.001)、气孔指数(t= 2.85,P= 0.004)和SPI指数(t= 25.63,P< 0.001)均显著大于肾型气孔器(图2)。进一步区分叶片上下表面进行分析，可以发现，上表面的4个气孔指标在两类气孔器间均存在显著差异，哑铃型气孔器的气孔长度(t= 19.51,P< 0.001)、气孔密度(t= 4.63,P< 0.001)、气孔指数(t= 2.76,P= 0.006)和SPI指数(t= 30.08,P< 0.001)均显著大于肾型气孔器；而下表面仅气孔长度和SPI指数在2类气孔器间存在显著差异，哑铃型气孔器的气孔长度(t= 23.99,P< 0.001)和SPI指数(t= 14.09,P< 0.001)均显著大于肾型气孔器(图2)。

在气孔指标的变异系数方面，4个气孔指标的变异系数均是肾型气孔器大于哑铃型气孔器。在两类气孔器中，气孔长度都是4个指标中稳定性最高(表1)。

无论是哑铃型气孔器还是肾型气孔器，其各气孔指标之间存在显著的相关关系。无论是总体水平上，还是区分上下表面，2种气孔器类型中，气孔长度和气孔密度均呈现显著的负相关(P<0.001)；气孔密度和气孔指数(P<0.001)、气孔密度和SPI指数(P< 0.001)、气孔指数和SPI指数(P< 0.001)则呈现显著的正相关(图3～5)。哑铃型气孔器的气孔长度和气孔指数存在显著的负相关(P< 0.001)，而肾型气孔器的气孔长度和气孔指数的关系不显著(图3～5)。

不同字母表示哑铃型气孔器和肾型气孔器有显著差异(P < 0.05)图2 2类气孔器气孔指标的比较Different letters indicate significant difference (P < 0.05)Fig.2 Comparison of stomatal characters between two types of stomata apparatus

表1 哑铃型气孔器和肾型气孔器总体及上下表面的气孔特征比较

注：同行不同字母表示哑铃型气孔器和肾型气孔器有显著差异(P< 0.05)，下同Note: The different letters indicate significant difference (P< 0.05). The same as below

图3 总体水平上2类气孔器气孔特征之间的关系Fig.3 The relationships between stomatal characters of two types of stomata apparatus on the overall level

2.2 哑铃型气孔器和肾型气孔器对环境因子的响应

2类气孔器的气孔特征对环境因子的响应存在不同。在总体水平上，哑铃型气孔器的气孔特征对海拔和年降水的响应较为显著，对年均温的响应相对较弱；而肾型气孔器的气孔则主要对海拔和年均温的响应较为显著，对年降水无显著响应(表2)。如果区分叶片上下表面进行分析，可以看出，上下表面的哑铃型气孔器，其气孔特征对环境因子的响应存在不同，上表面的气孔对年降水的响应并不显著，而下表面的气孔对年降水的响应较为显著；而对于上下表面的肾型气孔器而言，其气孔特征对环境因子的响应一致(表2)。

图4 叶片上表面2类气孔器气孔特征之间的关系Fig.4 The relationships between stomatal characters of two types of stomata apparatus on the adaxial surface

图5 叶片下表面2类气孔器气孔特征之间的关系Fig.5 The relationships between stomatal characters of two types of stomata apparatus on the abaxial surface

2.3 青藏高原和内蒙古高原两类气孔器气孔特征的比较

本研究中，2个地区物种本身对气孔特征存在较大影响，不同物种的气孔特征也存在显著差异。本研究重点关注2类气孔器类型之间的比较分析，未显示物种对气孔特征的影响。

哑铃型气孔器和肾型气孔器的气孔特征在不同地区也存在差异。对内蒙古高原和青藏高原2个地区的气孔特征进行t检验，结果(表3)显示，无论是哑铃型气孔器还是肾型气孔器，内蒙古高原的气孔长度(哑铃型t=-3.75,P<0.001；肾型t=-12.74,P< 0.001)显著低于青藏高原，内蒙古高原的气孔密度(哑铃型t=3.39,P=0.001；肾型t=7.01,P< 0.001)显著高于青藏高原(表3)。然而，对于气孔指数和SPI指数而言，哑铃型气孔器和肾型气孔器的地区差异存在不同。对于哑铃型气孔器的气孔指数，内蒙古高原大于青藏高原(t= 6.76,P< 0.001)，而肾型气孔器的气孔指数在2个地区无显著差异。SPI指数则刚好相反，肾型气孔器的SPI指数内蒙古高原低于青藏高原(t= -5.58,P< 0.001)，而哑铃型气孔器的SPI指数在2个地区无显著差异(表3)。

表2 气孔特征与环境因子的Pearson相关系数

注：表中**表示P< 0.01，*表示P< 0.05Note: ** meanP< 0.01, * meansP< 0.05

表3 青藏高原和内蒙古高原两类气孔器气孔特征的比较

注：不同字母表示不同地区同一指标差异显著(P< 0.05,t检验)Note: different letters indicate significant difference (P< 0.05,ttest)

表4 青藏高原和内蒙古高原哑铃型气孔器和肾型气孔器气孔特征与环境因子的Pearson相关系数

注：表中**表示P< 0.01，*表示P< 0.05Note: ** meanP< 0.01, * meansP< 0.05

在内蒙古高原和青藏高原，2种类型气孔器的气孔特征对环境因子的响应也存在不同。在2个地区，相比于哑铃型气孔器，肾型气孔器的气孔特征与环境因子的关系更为密切(表4)。在内蒙古高原，哑铃型气孔器的气孔特征对环境因子无显著响应，肾型气孔器的气孔指标对环境因子的响应更为显著(表4)。在青藏高原，哑铃型气孔器的气孔特征对年降水的响应更为显著，而肾型气孔器的气孔特征对海拔和年均温的响应更为显著(表4)。

3 讨 论

3.1 哑铃型气孔器与肾型气孔器的气孔特征

本研究中，哑铃型气孔器的气孔长度、气孔指数和SPI指数均显著大于肾型气孔器，而两者的气孔密度无显著差异。我们认为哑铃型气孔器的气孔长度大于肾型气孔器，可能与两者的保卫细胞特征和叶结构特点等有关。具哑铃型气孔器的叶片均为平行脉，叶表皮细胞有长细胞和短细胞的分化，气孔器均分布在长细胞一列，因而保卫细胞沿叶片长轴的伸展阻力相对较小。也有研究表明哑铃形保卫细胞细胞壁微纤丝排列方式与肾形保卫细胞不同(肾形保卫细胞纤维素微纤丝从孔向周围呈辐射状定向, 禾本科植物哑铃形保卫细胞球状部分纤维素微纤丝从孔向外放射)，其细胞膨压增加可以使气孔的孔径开张程度更大[23]，开闭速度更快，因而气体交换效率也更高，更能适应外界环境的变化[3]。SPI指数可间接表征光合效率，SPI指数在一定程度上代表叶片上气孔总面积，当叶片的SPI指数较高时，叶片在单位面积上的光合能力也比较强[24]。因而，相比肾型气孔器，哑铃型气孔器的光合和蒸腾效率更高，是一种进化的类型，更能适应环境胁迫。

本研究发现，肾型气孔器的气孔特征变异系数较大，而哑铃型气孔器的气孔特征变异系数较小。尽管在整体水平上，2类气孔器的气孔特征与环境因子均存在相关关系，但对两地区的比较可以看出：前者与环境的关系整体相对密切，而后者与环境的关系相对较弱。这说明相较于肾型气孔器，哑铃型气孔器的特征更稳定。以往的研究表明，气孔对叶片光合作用和蒸腾作用的调控，是通过短期的开闭行为和长期的形态、分布和数量的变化来共同实现的[15, 25]。正如气孔器可通过SD和SL的内部权衡来对外界环境进行响应[3, 26]，我们认为，气孔器对环境的瞬时响应和长期响应也存在一种内在关系，相互权衡与补充，共同应对外界环境变化。短期响应策略中反应较快或程度较大的植物，长期反应程度减小，表现为指标变化较小，反之亦然，短期和长期响应互为因果，共同应对环境胁迫。哑铃型气孔器的保卫细胞较长，能够迅速对外界环境的瞬时变化做出响应，使植物在应对环境短期变化时占优势[3]；而肾型气孔器的孔径较小，气孔开闭速度较慢，无法对外界环境的瞬时变化做出快速反应，因此在长期条件下，气孔特征需对环境变化做出响应。我们猜测，正是由于这个原因，肾型气孔器与环境因子的关系比哑铃型气孔器更为密切。此外，哑铃型气孔器仅见于禾本科和莎草科2个叶结构类似、亲缘关系较近的科，而肾型气孔器分布于双子叶植物和除禾草外的单子叶植物。具有肾型气孔器的植物，其遗传特征差异大、叶结构复杂，这可能也是2类气孔器各气孔指标变异系数存在差异的原因之一。

3.2 气孔特征对环境因子的响应存在不同

本研究发现，对于同一气孔器类型的草地植物而言，上下表面的气孔特征对环境因子的响应也可能存在差异。拥有肾型气孔器的草地植物，上下表面的气孔特征与环境因子的关系基本一致；而拥有哑铃型气孔器的草地植物，上下表面的气孔特征对环境因子的响应存在差异，上表面的气孔特征对降水无显著响应，而下表面的气孔特征对降水的响应较为显著。我们认为，这主要与拥有哑铃型气孔器的植物上表面的泡状细胞有关系。泡状细胞是分布于禾本科和莎草科植物叶片的一种特殊的大型薄壁细胞，其收缩可以使叶片近轴面内卷，帮助植物在一定程度上抵抗干旱，本研究发现所有哑铃型气孔器的植物，其上表面均具有泡状细胞(未发表结果)。当水分缺乏时，泡状细胞失水，体积减小，叶片向上卷起呈筒状，降低水分丧失；当水分充足时，泡状细胞吸水膨胀，叶片展平。这种内部调节在一定程度上可以缓解植物所受到的干旱胁迫，因此，拥有哑铃型气孔器的草地植物，叶片上表面气孔特征对水分的响应并不显著。与此同时，草地植物下表面无泡状细胞分布，植物需要通过改变气孔特征来适应外界环境的水分变化。因此，位于叶片下表面的哑铃型气孔器，其气孔特征对水分的响应较为显著。

此外，我们还发现，肾型气孔器的气孔特征对温度存在响应。当温度升高时，叶片的气孔导度和蒸腾速率加强，而较高的气孔密度与较高的气孔导度和光合速率之间存在正相关关系[3, 10]。因此，气孔密度随温度的升高而增大。气孔器内部SD和SL的权衡，则使气孔长度随温度的升高而减小。

在总体水平上，海拔对2种类型气孔器的气孔特征存在影响，这也与之前的研究相一致[12-14]。而哑铃型气孔器和肾型气孔器对温度和降水的响应则不同，哑铃型气孔器的气孔特征与降水的关系更为密切。肾型气孔器的气孔特征与温度的关系更为密切，这种现象是否具有普适性，尚需大量的实验数据和进一步的整合分析来验证。另外，也可通过开展室内控制实验等方法，从机理上探讨和分析2类气孔器气孔特征与温度和降水的关系，为该规律的解释提供依据。

3.3 两地区气孔指标存在差异

本研究发现，无论是肾型气孔器还是哑铃型气孔器，青藏高原的气孔长度均显著大于内蒙古高原，气孔密度显著小于内蒙古高原。也就是说，青藏高原草地植物的气孔大而疏，内蒙古高原草地植物的气孔小而密。之前有研究提出，低温会对芽原基中的幼叶分生组织细胞产生影响，使其发育为体积较大的表皮细胞[28]，而马建静等也通过实验证实，青藏高原草地植物的表皮细胞体积大于内蒙高原草地植物[19]。因而低温可能是导致青藏高原草地植物气孔长度大于内蒙古高原的原因之一。

此外，由于空气稀薄，高山植物具有发达的贮气组织，植物叶片中具有较大的细胞间隙[28-29]，导致单位面积内的细胞数量减少，气孔密度减少。

从结构对功能的适应性的角度考虑，内蒙古高原草地植物气孔特征小而密的特点，可以更加快速、有效地利用水分，帮助植物更好的抵抗干旱胁迫，适应干旱环境。青藏高原草地植物气孔特征大而疏，叶片建成投资中可以减少气孔形成过程的能量投资，这样可以将更多的能量用于抵抗低温胁迫，适应低温环境。

致谢：感谢北京大学青藏高原考察队、北京大学内蒙古考察队中各位老师同学在野外调查和样品采集过程中的协助，感谢丁金枝、寇丹等同学在数据分析中给予的帮助。