张翔宇 李金良 李旭廷 李思聪 张敏 王吴燕 杨锐

摘要：TLR4能识别内毒素脂多糖（LPS），在介導革兰氏阴性菌及其LPS的宿主反应中发挥重要作用，是研究肉兔抗病力的重要候选基因。为了研究TLR4在不同肉兔品种的突变情况，设计引物对2个不同肉兔品种的12个个体的TLR4部分编码区进行序列扩增，并比较其序列。结果表明，共检测到3个SNP位点，均为非同义突变。2个非同义位点（G628T和C653A）位于预测蛋白的亮氨酸富集区（LRR）区域。LRR区域发生的非同义突变，尤其是亮氨酸的改变和氨基酸极性的改变可能会影响TLR4对病原的识别，这些SNP位点将有助于肉兔抗病分子标记的研究。

关键词：肉兔；TLR4基因；单核苷酸突变；非同义突变；抗病力

中图分类号：S829.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2018）11-0100-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.11.025

Abstract： TLR4 could detect endotoxin by identifying lipopolysaccharide （LPS） and play a key role in host defense mediated by Gram-negative bacteria（LPS），therefore， TLR4 is a significant candidate gene for rabbit diseases resistance research. To identify nucleotide polymorphisms between two different breeds we designed primer pairs that amplified fragments of coding sequence（CDS） of 12 individuals， and compared the sequences. Comparative sequence analysis indicated that 3 SNPs were identified， all were non-synonymous SNPs. Two nonsynonymous SNPs（G628T and A653C） were located in the LRR domains of the predicted protein. The nonsynonymous SNPs in the LRR domains， especially related to leucine residues， may dramatically alter the ability to identified extracellular pathogens. The identification of these polymorphisms reported here increases the resource of genetic markers useful for association analyses with disease resistance and provides an important theoretical basis for disease resistant breeding of meat rabbits.

Key words： meat rabbits；TLR4 gene；SNP；nonsynonymous SNPs；disease resistance

Toll样受体首次在果蝇的胚胎发育中发现，称dToll。随后陆续发现人与其他哺乳动物存在与Toll类似的一组蛋白，称为Toll样受体[1，2]。Toll样受体广泛分布于机体各组织中，在识别病原相关分子模式中起重要作用，形成机体应对病原入侵的“第一道防线”[3]。TLR4是TLRs家族的重要成员之一，可以识别各种病原微生物成分，诱导机体的天然免疫和获得性免疫反应，TLR4基因变异可影响其受体结合配体的功能及其与配体结合以后的信号转导能力，对机体的病原识别和抗病性能具有重要影响[4]。研究表明，TLR4基因多态性与宿主的炎症应答及对传染性疾病的易感性存在关联[5]。TLR4属于细胞表面TLR，其结构分为胞外区、跨膜区和胞内区3个部分。胞外区有18～31个亮氨酸的重复序列（Leucine-rich repeats，LRRs），胞内区由Tol同源结构域 （Tolhomology domain，TH domain）和Toll样受体/白介素-同源结构域（Toll/L-1-receptor homologous region，TIR）构成。牛TLR4基因结构及其多态性与乳房炎的相关性研究已有较多报道，TLR4可能在宿主对乳房内感染应答反应中起重要作用[6]。人的TLR4基因多态性与消化系统疾病和呼吸系统疾病存在显著关联。兔TLR4基因多态性与消化系统疾病的易感性存在关联。四川白兔是中国珍贵的本地兔种资源，具有耐粗饲、适应能力强的特点。为了比较四川白兔与其他品种的遗传差异，本研究检测了2个不同品种的12只肉兔TLR4基因的遗传多态性，以期为肉兔TLR4基因的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品的采集和DNA抽提

样品来自2个不同品种（新西兰白兔和四川白兔）的12只肉兔，每个品种各6只，公母各半。采集静脉全血后-20 ℃保存。另外，采集1只新西兰白兔的腿肌，用于目的片段的确认和扩增条件的优化。利用Universal Genomic DNA Extraction Kit（TaKaRa公司）试剂盒抽提基因组DNA。

1.2 PCR扩增和SNP的检测

采用Web interface for Primer3（http：//frodo.wi.mit.edu/primer3）设计4对引物扩增肉兔TLR4基因的部分编码区，扩增产物部分重叠，引物序列见表1。PCR反应体系为25 μL：50～100 ng 模板DNA，上下游引物各0.4 μmol/L，2×Taq PCR MasterMix[天根生化科技（北京）有限公司]。PCR反应程序：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 1 min，连续循环30次；72 ℃延伸5 min。引物4的PCR程序除退火温度为58 ℃外，其他条件与上述相同。扩增产物经明胶电泳后，利用QIA Quick PCR Purification Kit进行纯化。纯化后的PCR产物利用ABI 3730XL进行测序。利用Sequencher 4.7软件进行SNPs的检测并进行人工核对。

2 结果与分析

为了检测目的區域的多态性，设计4对引物对目的区域进行扩增。扩增得到4段PCR产物，这些产物部分序列相互重叠，长度612～722 bp。序列拼接后得到2 080 bp的兔TLR4目的序列。通过对2个不同品种目的序列和参考序列（NM_001082781）的比对，共检测到3个SNP位点，均为非同义突变位点。其中1个为转换，2个为颠换。非同义突变在所检测的编码区的发生率（Polymorphism）为693 bp。突变位点所在基因组的位置，突变类型和氨基酸的位置见表2。检测到的非同义突变分布在TLR4的主要预测蛋白结构区域，包括亮氨酸富集区（LLR）。

3 讨论

TLRs在宿主识别入侵的PAMPs中起重要作用[7]，更多的证据表明TLRs在家畜识别PAMPs入侵中也同样发挥重要作用[8]。本研究共检测到3个SNPs，病原微生物的多样性可能是造成肉兔TLR4编码区序列存在多态性的主要原因。这些SNPs中或许存在对特定病原抗病力产生影响的SNPs。TLR4的多态位点主要分布在预测蛋白的胞外结构域。猪、牛和人的TLRs多态位点的比较分析表明，非同义突变主要存在于胞外结构域，尤其是LRRs区域[9]。胞外结构域在TLR4识别病原体相关分子模式中起重要作用。TLR4的多态性可以增加对PAMPs变异的识别能力，以应对病原微生物的快速进化。TLR4胞外结构域的非同义突变能提高宿主的免疫力，从而提高群体的生存能力[10]。LRRs区域的非同义突变，尤其是亮氨酸残基的改变，可能会明显改变宿主对胞外病原的识别能力[11]。位于兔TLR4 757位的非同义突变造成了氨基酸电荷的改变，而628和653位的突变造成了氨基酸极性的改变。无论是氨基酸电荷还是极性的改变，都有可能对TLR4蛋白的细胞外病原识别能力造成影响，进而影响宿主的抗病力。人类的TLR4突变位点的研究表明，TLR4突变造成了个体抗病力的下降[12]。TLR4首先通过结合CD14和MD-2等受体，再识别模式分子。因此，突变可能影响TLR4对受体的识别，进而影响其对病原的识别，对个体的抗病力造成不利的影响。

前期研究表明，TLR4的多态位点与多种炎症反应存在关联。C3H/HeJ品系小鼠对脂多糖（LPS）具有高度耐受性，而C57BL/10ScCr品系野生型小鼠对革兰氏阴性菌感染存在高度易感性，前者是由于TLR4基因胞质区域的1个点突变导致1个氨基酸从脯氨酸变为组氨酸而引起的错义突变，而后者在TLR4基因上出现了缺失，说明TLR4基因是LPS信号传递的关键[13]。TLR4多态位点与巴斯德肺炎球菌的感染存在关联。研究表明，TLR4蛋白259位的突变与呼吸道合胞病毒（RSV）的感染存在弱相关，TLR4两个单倍型也与RSV的感染有相关关系[14]。另外，TLR4基因与脓毒症、系统性红斑狼疮、风湿性关节炎、哮喘等疾病和肠炎等微生物感染所产生的疾病有关。TLR4基因多态性（Asp299Gly和Thr399Ileu）与胃炎相关性研究表明，TLR4基因Thr 399 Ileu突变可能是胃炎的一个致病因素，还可能与慢性炎症有关[15]。

目前，TLR4基因编码区内Asp299Gly和Thr399Ile 2个SNP位点的研究较多，且已证实与感染性疾病密切相关[16-18]。TLR4等位基因 Asp299Gly的突变将增加人体对革兰氏阴性菌的易感性，同时Asp299Gly等位基因与炎性反应有相关性。脓毒症发病的相关研究表明，Asp299Gly和Thr399Ile突变位点与脓毒症的发生有关联。该位点的突变型较易感染革兰氏阴性菌和患脓毒症，且死亡率较高。另外一项研究表明，上述SNPs位点与革兰氏阴性菌感染引起的败血症发生率密切相关[19]。基因敲除小鼠试验证实TLR4、MyD88均参与动脉粥样硬化的病理过程，Asp299Gly与动脉粥样硬化的发生存在关联。进一步研究表明，与Thr399Ile相比Asp299Gly可能更易影响TLR4的功能[20]。

4 结论

对2个不同品种肉兔TLR4的多态位点进行了检测，以期为进一步的关联分析和信号转导研究提供理想的候选基因。检测到的3个SNPs还将为绘制遗传连锁图和疾病关联分析提供有用的遗传标记。同时这些非同义SNPs也是下一步进行疾病关联分析的重要候选标记。

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