杨　盟，李朵璐，张雅迪，汪新茹，阚全程

(郑州大学第一附属医院 药学部，河南 郑州 450052)

肿瘤在分子基因水平上的高度异质性可能导致接受同种治疗方案时有不同的疗效和预后[1]。大量研究显示程序性死亡受体-配体1(programmed cell death-ligand 1,PD-L1)与乳腺癌患者预后相关，可作为一个潜在的生物标志物，且针对乳腺癌患者的抗PD-1/L1治疗的已取得一定的疗效。然而单一的抗PD-L1治疗并不能对所有的PD-L1+乳腺癌都有疗效[2]。因此了解乳腺癌分子水平上的差异及其临床特征的关联性对乳腺癌的生物治疗有重要的意义。p53在肿瘤中的研究多有报道，并且主要作用于肿瘤的发生发展过程。本实验主要研究乳腺癌组织中PD-L1和p53的关系。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1标本：收集郑州大学第一附属医院38例确诊为乳腺癌的组织标本，同时收取8例正常乳腺组织，所收组织均为原发性乳腺癌，未接受放化疗。该研究已获得本单位伦理委员会的批准及受试者签署的知情同意书。收集患者病理信息，查询患者p53阳性阴性表达情况并分组实验。

1.1.2主要试剂：(Ambion®) Trizol® Reagent(Life Technology公司)；PrimeScriptTMRT reagent Kit、SYBR Premix EX TaqTMⅡ[宝生物(大连)有限公司]；β-Actin引物(上海生工生物工程技术服务有限公司);PD-L1引物(Gengcopies公司)；兔抗人GAPDH单克隆抗体和兔抗人PD-L1多克隆抗体(Cell Signaling Technology公司)。

1.2方法

1.2.1RT-qPCR检测PD-L1 mRNA：称取0.1 mg组织于无酶离心管内，加入1 mL Trizol，使用组织匀浆机研磨，室温静置5 min，将匀浆液全部转移至另一新的无酶离心管中，加入200 μL氯仿，充分震荡混匀，室温静置10 min，4 ℃，12 000 r/min离心10 min，吸上清400～500 μL至另一无酶离心管内，加入等体积异丙醇轻轻混匀，室温静置10 min，4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，弃上清，1 mL 75%乙醇润洗沉淀，4 ℃ 7 500 r/min离心5 min，弃乙醇，无酶水溶解沉淀，57 ℃ 15 min孵育；NANO DROP 2000测RNA浓度，且A260/280在1.9～2.0中间。取1 μg RNA反转录，按照说明书进行操作。荧光定量PCR实验按照两步法操作：预变性：95 ℃ 30 s；PCR反应：95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s， 40个循环。β-actin上游引物：5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′，下游引物：5′-GGGCCGGACTCGTCATAC-3′;PD-L1上游引物：5′-TCC ACTCAATGCCTCAAT-3′，下游引物：5′-GAAGACC TCACAGACTCAA-3′。2-△△CT法分析数据。

1.2.2Western-blot检测PD-L1蛋白：p53阳性和阴性的正常乳腺组织和癌组织各取两对，N代表正常乳腺组织，C代表癌组织，加适量蛋白裂解液匀浆提蛋白，BCA法测蛋白浓度；取30 μg蛋白变性，加样，电泳，转膜，封闭，加一抗过夜，次日加荧光二抗，扫NC膜，整理图片及数据，吸光值统计采用Image Studio Ver 2.0软件。

2　结果

2.1p53阳性和阴性组乳腺癌组织中PD-L1的mRNA相对表达： p53阳性组中，PD-L1在癌组织表达高于正常乳腺组织(P<0.05)；且p53阳性组显著高于p53阴性组PD-L1表达(P<0.001)(图1)。

2.2配对p53阳性和阴性组乳腺癌组织中PD-L1蛋白的相对表达：在p53阳性组中，两组癌组织PD-L1蛋白表达稍高于正常乳腺组织，而在p53阴性组中，两组癌组织PD-L1蛋白表达稍低于正常乳腺组织(图2)。

2.3乳腺癌组织病理参数：(表1)。

3　讨论

由于免疫反应的不断发展，单个免疫生物标记预测药物疗效并不能取得满意的结果， 取而代之的是一个基于生物标志、多靶点综合考虑及药物联合应用的趋势。本研究发现在乳腺癌中PD-L1的表达与p53的阳性表达呈正相关。此外病理数据分析显示Ki- 67在ER、PR阳性乳腺癌中的表达率高于ER、PR阴性的乳腺癌中的表达率。同时本研究还观察到乳腺癌组织中p53阳性表达率为52.63%(20/38)，这与肝癌中p53的阳性表达率60.94%[3]、晚期结直肠癌中p53的阳性表达率为63%[4]基本一致。

A.PD-L1 mRNA relative expression in p53 positive cancer tissue and normal breast tissue; B.PD-L1 mRNA relative expression in p53 negative cancer tissue and normal breast tissue；C.PD-L1 mRNA relativein expression of the group of p53 positive and p53 negative cancers to express the result of contrast；*P<0.05 compared with normal group；**P<0.0001 compared with negative group

A,C.expression of PD-L1 protein in normal breast tissue and carcinoma tissues of p53 positive group；B,D.expression of PD-L1 protein in normal breast tissue and carcinoma tissues of p53 negative group

图2　乳腺组织和乳腺癌组织PD-L1蛋白表达Fig 2　Expression of PD-L1 protein of breast tissue and breast cancer

-.no data;*P<0.05.