成丽琴，张祝琴，陈厚早

(中国医学科学院基础医学研究所 北京协和医学院基础学院 医学分子生物学国家重点实验室， 北京 100005)

肝细胞癌(以下简称肝癌)是全球最常见的恶性肿瘤，也是中国死亡率最高的癌[1]。目前中国肝癌的治疗首选手术切除，而不能手术的患者则以化疗为主[2]。皮下注射干扰素α(interferon α, IFNα)作为一种简单、方便、价格相对便宜的方法，对提高肝癌患者远期生存率有明显的效果[3-4]。

IFNα 是干扰素家族的I型IFN，因其抗肿瘤效应而被熟知。一方面，它可以直接抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡；另一方面，它可以通过促进抗肿瘤免疫反应发挥作用[5]。用IFN α处理6 h后，肝癌细胞系Huh7的cDNA基因表达谱芯片显示，胞苷单磷酸激酶2(cytidine/uridine monopho-sphate kinase 2, CMPK2)的转录水平显著上调[6]。CMPK2是位于线粒体的参与核苷酸补救途径的酶。据报道，CMPK2在巨噬细胞的激活中发挥重要作用[7]。本研究拟对CMPK2在IFNα治疗肝癌中的抗肿瘤免疫反应作用进行探讨。

1　材料与方法

1.1　材料

1.1.1细胞系：人肝癌细胞系Huh7、人胚胎肾上皮细胞系293T和小鼠巨噬细胞系RAW264.7(本实验室保存)。

1.1.2主要试剂：DMEM培养基(中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心)；胎牛血清(Gibco公司); CMPK2质粒和抗体Anti-CMPK2 (Origene公司); Aldrich RNA提取裂解液Trizol(Invitrogen公司); 脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)和β-actin抗体(Sigma-Aldrich公司)；注射用重组人IFNα(天津未名生物医药有限公司); 反转录试剂盒(TaKaRa公司); 实时定量PCR(RT-qPCR)试剂盒(Vazyme公司); BCA蛋白定量试剂盒(赛默飞公司); 信号传导转录激活因子1(signal transducers and activators of transcription 1, STAT1)的抗体和P-STAT1抗体(Cell Signaling Technology公司); 细胞裂解液RIPA和蛋白上样缓冲液(上海碧云天生物技术有限公司); PVDF膜(Millipore公司)；ECL化学发光试剂(上海翊圣生物科技有限公司)；CellTiter-Glo 2.0三磷酸腺苷(adenosinetriphosphate, ATP)荧光检测试剂盒(Promega公司)。

1.2　方法

1.2.1细胞培养: 37 ℃、5% CO2及饱和湿度条件下，将Huh7和293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM完全培养基中，将RAW264.7细胞培养于含10%胎牛血清的1640完全培养基中。

1.2.2构建稳定过表达CMPK2的Huh7细胞: 分别用限制性内切酶EcoRI-HF和NotI-HF对pLV-EF1a-EGFP-N和pCMV6-ENTRY-CMPK2质粒进行双酶切后胶回收，用T4连接酶链接目的片段，构建过表达CMPK2的慢病毒质粒。将CMPK2的慢病毒质粒与 psPAX和pMD2.G质粒共同转染293T细胞，48 h后收集上清液，于4 ℃、4 000×g离心10 min，除去细胞碎片，用0.45 μm过滤器过滤上清液，加入超速离心管中，40 000×g离心4 h，去上清，用1 mL DMEM完全培养基溶解沉淀，得到过表达CMPK2的慢病毒(lenti-CMPK2)。将得到的lenti-CMPK2感染Huh7细胞，48 h后用嘌呤霉素筛选出成功感染了lenti-CMPK2的细胞，得到稳定过表达CMPK2的Huh7细胞。以过表达EGFP的慢病毒作为对照(lenti-GFP)。

1.2.3RNA反转录及RT-qPCR 检测CMPK2、白介素-1β (interleukin 1β, IL1β)、IL18、肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor α, TNFα)、IL6、C-C模体趋化因子配体5 (C-C motif chemokine ligand 5, CCL5)和诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase, iNOS) 的转录水平：用Trizol提取细胞总RNA，测定浓度及纯度后，用反转录试剂盒将RNA反转成cDNA，再用RT-qPCR试剂盒检测各基因的转录水平，以β-actin为内参，用2-△△CT法分析各基因的相对表达量。所使用引物见表1和表2。

表1　Huh7细胞系RT-qPCR 引物序列

表2　RAW264.7细胞系RT-qPCR 引物序列

1.2.4Western blot检测CMPK2、P-STAT1和STAT1的蛋白水平：收集细胞，用蛋白裂解液(RIPA)裂解细胞，超声匀浆后离心提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白样品进行SDS-PAGE，转膜并封闭，分别用抗目的蛋白抗体(一抗)(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。次日室温加相应的二抗(1∶5 000)孵育，洗膜后进行曝光、显影和定影。以β-actin为内参进行分析。

1.2.5CellTiter-Glo ATP荧光检测：将细胞计数后等量接种于24孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM完全培养基培养6 h后，分离培养基与细胞，取50 μL培养基或PBS重悬的细胞于96孔板中，加入等体积的CellTiter-Glo试剂，震荡混匀5 min，室温孵育10 min，通过多功能酶标仪读出荧光信号。

1.3　统计学分析

2　结果

2.1　IFNα诱导Huh7细胞CMPK2高表达

IFNα处理Huh7细胞6 h后CMPK2的转录水平显著增加(95.44±4.26)，而LPS处理组Huh7细胞 CMPK2水平与对照组无明显差别(图1A)。IFNα处理后，其他免疫细胞激活时高表达的细胞因子IL1β、IL18和TNFα中，仅有IL1β的转录水平有上调(1.54±0.11)，但增加的水平远低于CMPK2(图1B～D)。

2.2　IFNα诱导Huh7细胞CMPK2表达的时间和浓度效应

浓度为1×105U/L的IFNα即可使Huh7细胞中CMPK2的转录水平显著上调(66.46±1.72)，当IFNα浓度为(1～5)×106U/L时上调最为明显(图2A)。IFNα处理Huh7细胞1 h即可检测到CMPK2 转录水平的上调(6.16±0.60)，6 hCMPK2转录水平到达高峰(102.10±1.03)，12 h仍维持在较高水平(90.84±1.44)，24 h出现明显的回落(21.34±1.23)，并不断下降，但到96 hCMPK2的转录水平仍高于无IFNα处理的对照组(图2B)。1×106U/L IFNα 处理Huh7细胞6 h后，CMPK2的蛋白水平和STAT1的磷酸化水平也显著上调(图2C)。

2.3　通过感染慢病毒构建稳定过表达CMPK2的Huh7细胞

在感染稳定表达CMPK2慢病毒的Huh7细胞中，CMPK2的转录水平(20.76±0.94)和蛋白水平均显著高于过表达GFP的对照组(图3A, B)。

A.RT-qPCR detection of CMPK2 expression in Huh7 cells under the treatment of IFNα (1×106U/L), LPS(1mg/L) respectively; B,C,D.RT-qPCR detection of the expression of IL1β(B), IL18(C) and TNFα(D) in Huh7 cells after treatment with IFNα(1×106U/L)for 6 hours;*P<0.05,**P<0.0001 compared with the control group

A.RT-qPCR detection ofCMPK2 expression in Huh7 cells 6 hours after the treatment of IFNα with the indicated concentration (n=3); B.RT-qPCR detection ofCMPK2 expression in Huh7 cells after the treatment of IFNα(1×106U/L) for the indicated time (n=3); C.Western blot analysis of CMPK2, PY701-STAT1 and STAT1 in Huh7 cells with and without the stimulation of IFNα(1×106U/L) for 6 hours(n=4);*P<0.01,**P<0.001,***P<0.0001 compared with the control group

A.RT-qPCR detection ofCMPK2 expression in Huh7 cells, lenti-GFP treated Huh7 cells and lenti-CMPK2 treated Huh7 cells; B.Western blot analysis of CMPK2 in lenti-GFP treated Huh7 cells and lenti-CMPK2 treated Huh7 cells;*P<0.01 compared with the control group;#P<0.01 compared with lenti-GFP treated Huh7 cells

2.4　CMPK2上调Huh7细胞及其上清中ATP水平

IFNα处理6 h后，Huh7细胞及其上清中ATP水平显著上调(图4A～B)。稳定过表达CMPK2的Huh7细胞及其上清中的ATP水平也显著高于对照组(图4C～D)。

2.5　CMPK2上调巨噬细胞中炎性因子的表达

稳定过表达CMPK2的Huh7细胞的上清处理巨噬细胞6 h后，巨噬细胞中IL1β(1.70±0.08)、IL6(4.32±0.15)和CCL5(1.42±0.07)的转录水平明显高于对照组(图5A～D)。

3　讨论

巨噬细胞在LPS和IFNα等刺激下激活向M1型巨噬细胞极化过程中，CMPK2和炎性因子的表达水平显著上调[7-8]。本研究发现，IFNα处理后肝癌细胞系Huh7中CMPK2的转录水平和蛋白水平显著上调，巨噬细胞激活过程中高表达的炎性因子在Huh7细胞中增加的水平远低于CMPK2，而LPS处理后Huh7细胞中 CMPK2水平无明显改变。

STAT1Y701的磷酸化在干扰素刺激基因的表达中发挥重要作用，STAT1Y701的磷酸化水平在IFNα处理0.5 h后显著上调，到24 h下降至较低水平[9]。本研究中IFNα处理6 h后Huh7细胞中STAT1Y701的磷酸化水平显著上调，IFNα处理Huh7细胞1 h即可检测到CMPK2 转录水平的上调，6 h CMPK2的转录水平到达高峰，到24 h CMPK2 的转录水平出现明显的回落，提示 STAT1Y701的磷酸化可能促进CMPK2的转录激活。

CellTiter-Glo 2.0 Assay detects the ATP level in the cells(A) and supernatant(B) of Huh7 cells with or without the treatment of IFNα (1×106U/L) for 6 hours, and the cells(C) and supernatant(D) of CMPK2 overexpressing Huh7 cells; the ATP level is displayed by rLuciferase(RLU) luminescent signal；*P<0.01,**P<0.0001 compared with the control group

RT-qPCR detection ofIL1β(A),IL6(B),CCL5(C) andiNOS(D) in RAW264.7 cells 6 hours after the treatment of the supernatant of CMPK2 overexpressing Huh7 cells;*P<0.01,**P<0.0001 compared with the control group

图5过表达CMPK2的Huh7细胞上清激活巨噬细胞中炎性因子的表达

CMPK2催化单磷酸核苷变成相应二磷酸核苷，可进而促进三磷酸核苷的合成[7]。现有报道，ATP等三磷酸核苷可以作用于巨噬细胞表面的嘌呤受体(purinergic receptor)，进而激活巨噬细胞，诱导IL1β等细胞因子的表达[10]。本研究发现CMPK2显著上调Huh7细胞及其上清中ATP的水平，稳定过表达CMPK2的Huh7细胞上清处理巨噬细胞6 h后，巨噬细胞中IL1β、IL6和CCL5的转录水平明显高于对照组。提示IFNα上调肝细胞中的CMPK2，增加ATP的水平，通过肝脏中枯否细胞的旁分泌，促进抗肿瘤免疫反应。其具体机制还需进一步的实验来进行验证。本研究为进一步阐明IFNα治疗肝癌中的抗肿瘤免疫作用提供了基础，对提高干扰素治疗效率，实现个体化治疗具有重要意义。