刘亚举，龙　飞，李　瑾，岳俊涛，石美森

(1.河南省许昌市公安局 刑事科学技术研究所，河南 许昌 461000；2.贵州省遵义市公安局 刑侦支队，贵州 遵义 563000； 3.中国政法大学 证据科学教育部重点实验室， 北京 100192)

由于人类X染色体独特的遗传性质，X染色体短串联重复序列(X chromosome-short tandem repeat，X-STR)在法医实践中具有独特的应用价值[1]，在父母缺失的同父异母姐妹鉴定、祖母-孙女关系鉴定、父女关系鉴定、个体识别中性别的辅助检验和男性混合样本的判读等案件中往往能提供一定的证据信息。本研究采用MicroreaderTM19X ID System身份鉴定系统19X试剂盒，对中国汉族、仡佬族和苗族人群进行19个X-STR基因座的遗传多态性调查，评估其作为法医学遗传标记的效能，积累相应X-STR基因座群体遗传学数据，为法医个体识别和亲子鉴定提供资料。

1　材料与方法

1.1　样本

根据知情同意原则，从健康体检人群中随机采集汉(308名，男女各154名)、仡佬(398名，男性296名、女性102名)和苗(323名，男性220名、女性103名)族无关个体外周血0.1 mL，滴入采血卡(武汉骥腾公司)，阴干后常温保存。该研究得到相关道德伦理委员会批准。

1.2　方法

根据MicroreaderTM19X ID System荧光检测试剂盒说明书，用直扩法(免提取)对前述血样进行PCR扩增。在Mastercycler pro S银座热循环仪(Eppendorf公司)上进行复合扩增，反应体系为10 μL，内含2.5×缓冲液C 4 μL、5×19X Primer Mix 2 μL、Taq PolymeraseⅡ 0.2 μL、纯水3.8 μL和1.2 mm直径血样。热循环参数为：96 ℃ 2 min；94 ℃ 5 s，60 ℃ 70 s，30个循环； 60 ℃ 30 min；15 ℃保温。取1 μL扩增产物与0.5 μL内标Org500和8.5 μL去离子甲酰胺混合，95 ℃变性3 min后，冰浴3 min，置3500XL型遗传分析仪(AB公司)上全自动毛细管电泳，Data Collection软件收集数据，用GeneMarker® HID分析软件(SoftGenetics公司)进行等位基因分型，并采用GeneMapper ID-X v1.5分析软件(AB公司)复核分析。每批样本检测均采用 9947A(AB公司)和超纯水分别作为阳性对照和阴性对照。19个X-STR基因座的基本信息(表1)。

1.3　统计学分析

用PowerMarker® v3.25软件分别统计3个民族的男性个体和女性个体在19个X-STR基因座的等位基因分布频率。用Arlequin v3.5软件对男性群体和女性群体之间各基因座的等位基因频率分布差异进行Fisher，s精确检验，并对19个X-STR基因座在3个民族群体中的基因型分布进行Hardy-Weinberg平衡检验及各个基因座间的连锁不平衡情况进行检验。同时用PowerMarker® v3.25软件和Cervus3.0软件统计19个X-STR基因座在3个民族无关个体中的等位基因分布频率,使用http://www.chrX-STR.org网站[2]在线计算功能，用男女合并后数据计算所得等位基因频率，统计分析各个基因座在男性群体的个人识别率(DPM)，在女性群体的个人识别率(DPF)、杂合度(H)、三联体平均非父排除率(MECtrio)、二联体平均非父排除率(MECduo)和多态信息含量(PIC)等法医学参数值[3- 4]。采用Arlequin v3.5软件进行19个X-STR基因座的等位基因分布与其他地区已有人群数据[5- 7]的差异比较。

表1　19个X-STR基因座的基本信息Table 1　General information of 19 markers included in the MicroreaderTM19X ID system

2　结果

2.1　19个X-STR基因座的检测结果

经阳性对照9947A反复测试，结果未见明显变化。等位基因分型标准物(ladder)和3个民族1 029名无关个体均获得清晰的电泳图谱，分型结果明确(图1)。男性个体每个基因座均只显现一个等位基因峰，女性个体则有1个(纯合子)或2个等位基因(杂合子)峰。

2.2　19个X-STR基因座的等位基因频率分布

308名汉族(男女各154名)、398名仡佬族(男性296名，女性102名)和323名苗族(男性220名，女性103名)无关个体中分别检出172、176和186种等位基因。经Fisher’s精确检验，男性和女性群体等位基因的频率分布差异无统计学差异，因此用男女合并后数据计算所得人群等位基因频率分布(表2，Freq1汉族、Freq2仡佬族、Freq3苗族)。等位基因分型标准物之外的稀有等位基因(off-ladder allele)被检出(表2中粗体标记的等位基因)。

2.3　群体遗传学参数

19个X-STR基因座中，汉族除DXS10162外，仡佬族除DXS9907、DXS7423、DXS6810、GATA165B12及DXS10135外，苗族除DXS6795、DXS6800、DXS981及DXS10162外，基因型分布均符合Hardy-Weinberg 平衡(P>0.05)，采用Bonferroni法修正，将P值设为0.0026(0.05/19)，发现19个X-STR基因座的基因型频率分布在3个民族群体中均达到Hardy-Weinberg平衡(P>0.05)。19个X-STR基因座在3个民族人群的遗传学参数(表3)。

2.4　19个X-STR基因座的基因连锁不平衡分析

对19个X-STR基因座两两之间进行连锁不平衡检验，所有基因座两两之间均处于连锁平衡状态。

图1　等位基因分型标准物和内标分型图普Fig 1　Electropherogram of allelic ladders and internal size standard in the MicroreaderTM19X ID system

DXS6807DXS7423DXS9902alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3100.0025130.00490.01010.007770.00320.0050110.41720.45100.4907140.30680.30280.309680.00320.0031120.00810.00880.0077150.63470.63440.617590.02270.01880.0124130.02920.01380.0139160.04870.05150.0619100.44160.46110.4892140.32470.36930.3437170.00490.00130.0031110.31660.32290.3096150.18510.14200.1331120.20450.18340.1811160.03080.01260.0077130.00810.00750.0046170.00490.0031140.0013DXS6810DXS7133GATA165B12alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3alleleFreq1Freq2Freq3140.003260.00490.00500.001570.0016150.00320.003870.004680.0025160.00970.00500.006280.00160.00750.006290.22560.27140.2895170.16070.16080.140990.74510.77760.7910100.55680.49120.4783180.48860.54020.5866100.19640.17590.1378110.18510.18340.1563190.32310.28390.2399110.05190.03270.0588120.03080.05150.0511200.01140.00630.0232120.0013130.0248210.0031

续表2

续表2

2.5　与其他地区人群X-STR基因座的频率分布比较

对本研究的3个民族之间的频率分布进行比较分析，并分别与河南汉族(n=326)[5]、山东汉族(n=481)[6]、华东汉族(n=200)[7]群体比较，结果见表4[表中粗体标记的差异具有统计学意义(P<0.05)；-表示没有数据]。

表3　19个X-STR基因座的群体遗传学参数及Hardy-Weinberg平衡检验结果(P值)

续表3

表4　不同人群间X-STR基因座的等位基因频率分布差异检验结果(exact P值)Table 4　Exact P values based on the comparison of allele frequencies in 6 national studies

续表3

3　讨论

X-STR基因座核心重复单位有3和4核苷酸，本研究的19个X-STR基因座4核苷酸居多，有17个，占89.47%，因为扩增产物中这类基因座比3核苷酸重复序列的影子带少。另外，19个X-STR基因座的选择也避开了4个连锁群[8- 9]，连锁度较低。

人类群体是一个具有多样性特征的大群体，每一个种族的基因组经过长期进化过程而具有其自身所特有的征象，通过对各个种族的遗传结构特点及变化规律的研究，有助于在法医DNA、人类进化、种族起源和族群关系等方面的研究。中国有56个民族，研究中国不同民族群体的遗传多态性，不仅对全面了解各民族群体的遗传多态性和他们之间的相互关系有着非常重要的意义，同时也可以为探讨人群的起源及迁徙路线提供重要的科学依据。因此，X-STR基因座在不同人群的多态性数据是法医DNA应用、群体遗传学研究的基础，不同地域、不同民族X-STR基因座的频率分布存在差异，能够为群体遗传学和种群识别带来一定的促进作用[8- 9]。本次群体差异比较显示，19个X-STR基因座在不同区域和不同种族之间具有差异，所以，在进行法医学证据价值评估时选择对应的群体是科学和必要的，这种结果也将为了解种族的起源与流转及其语言学、考古学等学科提供重要的理论依据和参考资料。

多态性分析结果表明，19个X-STR基因座中，DXS7133和DXS6800具有中度多态性，其余17个基因座均具有高度多态性(PIC>0.5，H>0.5)，经Bonferroni法修正，将p值设为0.0026(0.05/19)，发现19个X-STR基因座的基因型频率分布在3个民族群体中均达到Hardy-Weinberg平衡，在汉、仡佬、苗族女性群体和男性群体中的累积个人识别率(CDP)分别为1～6.9199×10-18和1～5.4584×10-11、1～7.1551×10-18和1～6.1816×10-11、1～5.4507×10-18和1～4.8230×10-11，在汉、仡佬、苗族三联体和二联体中的累积平均非父排除率(MEC)分别为0.999 999 999 3696和0.999 999 5255、0.999 999 999 3699和0.999 999 5412、0.999 999 999 4723和0.999 999 5994。系统效能达到了法医DNA检验的要求，是一组理想的X-STR遗传标记，能为疑难亲缘鉴定案件的鉴定提供有效的手段，在法医学鉴定中有较高的应用价值。

综上所述，本研究获得了中国汉、仡佬和苗族群体19个X-STR基因座的等位基因频率分布数据，为建立这3个民族群体X-STR分布数据库、法医学应用及遗传关系的分析提供了良好的遗传背景数据。