任嘉兴，张锦华，白宝清，范三红

（山西大学生命科学学院，山西太原 030006）

羊肚菌是一种珍贵的野生菌[1]。菌类的生物活性已经被大多数人熟知。据报道，菌类多糖具有抗癌活性[2]、降血脂[3]、抗辐射[4]等功效。

贾建会等[5]研究结果表明，羊肚菌多糖在提高免疫力方面具有良好的功效。胡彦营等[6]试验结果表明，羊肚菌多糖具有一定的抗疲劳功能。段巍鹤等[7]利用羊肚菌菌丝体胞内多糖灌胃小鼠，结果表明，羊肚菌胞内多糖具有应急性抗疲劳保健作用。杨芳等[8]研究结果表明，羊肚菌多糖具有较好的抗氧化性。

现有的多糖提取方法表明，多糖在酸性条件下结构被破坏，得率较低；而碱提法虽然得率较高，但提取过程复杂[9]。本试验利用响应面法，优化羊肚菌多糖提取工艺，并进行体外抗氧化试验，以期为羊肚菌进一步研究提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 材料

羊肚菌子实体购买于山西省安泽县。

1.2 试剂及仪器设备

DPPH购自美国Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。

AL204型电子分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；HRHS24电热恒温水浴锅，青岛海尔医用低温科技有限公司；SHB-III循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；SP-2000UV型紫外可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；SC-3614低速离心机，安徽中科中佳科学仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 羊肚菌多糖提取流程工艺 将羊肚菌在40℃条件下烘4 h，粉碎过0.2 mm孔径筛。称取3.00 g羊肚菌粉末置于锥形瓶，恒温水浴，4 500 r/min离心15 min，上清液浓缩，加入4倍体积无水乙醇，4℃冰箱中醇沉12 h，离心，沉淀干燥得粗多糖。

1.3.2 单因素试验 固定提取时间3 h、提取温度85 ℃，测定不同液料比（30∶1，40∶1，50∶1，60∶1，70∶1（mL/g）下羊肚菌多糖的得率；固定液料比40∶1（mL/g）、提取温度 85℃，测定不同提取温度（55，65，75，85，95 ℃）下羊肚菌多糖的得率；固定液料比 40∶1（mL/g）、提取时间 3 h，测定不同提取时间（1，2，3，4 h）下羊肚菌多糖的得率。

1.3.3 响应面优化试验 在单因素试验基础上，设计响应面试验并进行分析。

1.4 测定项目及方法

1.4.1 羊肚菌多糖含量的测定 采用苯酚-硫酸法[10]测定多糖含量，以吸光度值A为横坐标，质量浓度C（mg/mL）为纵坐标，得到线性回归方程。

1.4.2 多糖得率计算 根据标准曲线，按式（2）求得多糖得率。

式中，W1为样品质量；W2为W1提取的粗多糖质量；W3为从W2中称取的用于测定的粗多糖；V为定容W3的体积；C为多糖的质量浓度。

1.4.3 羊肚菌多糖对DPPH自由基清除能力的测定 按照文献[11]的方法，向试管中加入2 mL不同浓度的多糖溶液、2mLDPPH溶液，避光放置30min，517 nm波长处测定吸光度值。本底用无水乙醇代替DPPH测定吸光度值；对照组用蒸馏水代替样品液。以Vc为阳性对照，按式（2）计算清除率。

式中，A1为不同浓度多糖溶液吸光度；A2为样品本底吸光度；A0为对照溶液吸光度。

1.4.4 羊肚菌多糖对羟自由基（·OH）清除率的测定 在试管中依次加入9 mmol/L FeSO4溶液、9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、不同浓度多糖溶液1 mL以及30%的H2O2溶液1.0 mL，静置30 min，510 nm波长处测定吸光度值。本底用蒸馏水代替H2O2。对照组用蒸馏水代替样品，以Vc为阳性对照[12]，按式（3）计算样品对·OH的清除率。

式中，A3为不同浓度多糖溶液吸光度；A4为样品本底吸光度；A0'为对照溶液吸光度。

1.4.5 羊肚菌多糖还原力测定 取不同浓度多糖溶液1.0 mL于试管中，加入0.2 mol/L磷酸缓冲液、2.0 mL的K3（Fe（CN）6），50℃水浴30 min，冷却，加入2.0mL三氯乙酸。吸取反应液2.0mL，加入2.0mL蒸馏水、0.4 mL FeCl3溶液，混匀，暗室反应30 min，700 nm处测定吸光度。以Vc为阳性对照[13]。

2 结果与分析

2.1 羊肚菌多糖提取单因素试验

2.1.1 液料比对多糖得率的影响 由图1可知，当液料比为40∶1（mL/g）时，多糖得率最高；再增加液料比，多糖得率降低。可能是由于增加溶剂浸提物与溶剂接触面积增大，多糖溶出较多，继续增加溶剂用量使多糖的溶出达到饱和[14]。从实际试验条件出发，提取液料比以40∶1（mL/g）为宜。

2.1.2 提取温度对多糖得率的影响 由图2可知，温度低于85℃，随温度升高，多糖得率增加；85℃时，多糖得率达到最高，为2.65%；温度高于85℃时，多糖得率降低。可能是由于多糖的糖苷键被高温破坏，得率降低[15]。因此，提取温度应以85℃为宜。

2.1.3 提取时间对多糖得率的影响 由图3可知，提取时间低于3 h时，多糖得率上升；提取时间高于3 h时，随提取时间的增加，多糖得率逐渐下降。可能是因为提取时间短，多糖与提取液反应不充分；提取时间过长，多糖分解，得率降低。因此，提取时间3 h为宜。

2.2 响应面分析法对羊肚菌多糖提取工艺的优化

表1 响应面试验水平

表2 Box-Behnken试验设计及结果

根据单因素试验结果，对影响羊肚菌多糖得率的3个因素进行响应面优化试验，结果列于表1，2。

2.2.1 响应面试验结果分析及回归方程 根据表2试验结果，利用DesignExpert 8.0.6软件进行分析，得到回归方程为：Y＝-107.06338+0.31568A＋2.11058B＋7.94225C＋0.00675AB－0.010750AC＋0.02525BC－0.010710A2－0.014060B2－1.54850C2。

表3 回归方程方差分析结果

从表3可以看出，回归模型P＜0.01，极显著；失拟项P＞0.05，不显著。说明该回归方程拟合效果好。模型中一次项 B、二次项 A2，B2，C2，交互项 AB影响极显著；一次项C影响显著。对多糖得率的影响从大到小为B＞C＞A。该回归方程对提取羊肚菌多糖提供了一个合适的模型。

2.2.2 各因素交互作用对多糖得率的响应面分析响应面分析法通过确定的试验对试验因素进行分析。从图4可以看出，提取温度与液料比交互作用极显著，液料比在（35∶1）～（45∶1），提取温度在80～90℃，提取时间在2.5～3.5 h时，羊肚菌多糖得率达到最大值。液料比、提取时间的增加，提取温度的升高，都不利于多糖的提取。

2.2.3 最优工艺参数的确定 通过Design-Expert 8.0.6软件分析得出，羊肚菌多糖提取最佳条件为液料比40.78∶1（mL/g）、提取温度87.67℃、提取时间3.14 h，在此条件下预测多糖得率为4.35%。综合考虑，将提取条件修正为液料比41∶1（mL/g）、提取温度88℃、提取时间3 h，在此条件下重复3次，多糖得率稳定在4.24%±0.17%，与预测值基本一致，模型可靠，具有实际应用价值。

2.3 羊肚菌多糖体外抗氧化测定

2.3.1 羊肚菌多糖对DPPH自由基的清除作用活性成分与DPPH的电子结合，517 nm处DPPH吸收减弱，由此可以评价物质对自由基的清除能力[18]。从图5可以看出，多糖质量浓度从0.2 mg/mL增加到1 mg/mL，DPPH自由基清除率从10.41%增加到52.21%，多糖质量浓度为1 mg/mL时，清除能力是对照Vc的55.37%，表明羊肚菌多糖能较好地清除DPPH自由基。

2.3.2 羊肚菌多糖对·OH的清除作用 利用在体系中加入清除·OH的物质与水杨酸竞争吸收·OH从而降低吸光度的原理评价物质清除·OH的能力[19]。从图6可以看出，多糖质量浓度从0.2 mg/mL增加到1.0 mg/mL，·OH自由基清除率从39.29%增加到79.77%，浓度为1 mg/mL多糖质量的清除能力是对照Vc的79.83%，表明羊肚菌多糖清除·OH自由基能力较强。

2.3.3 羊肚菌多糖的还原能力 从图7可以看出，Vc的还原能力先快速增加，随后保持不变；羊肚菌多糖的还原能力变化不大，且弱于Vc。由此可知，羊肚菌多糖具有一定的还原能力。

3 结论

本试验以羊肚菌子实体为原料，水提醇沉法提取多糖，结果确定最优提取条件为：液料比41∶1（mL/g）、提取温度88℃、提取时间3 h，在此优化条件下，羊肚菌多糖的得率稳定为4.24%±0.15%；羊肚菌多糖对DPPH和·OH自由基有明显的清除作用，并与其浓度呈正相关，且具有一定的还原能力，这为羊肚菌进一步研究提供了理论依据。