李 希，王 曦，吴苏君

（山西省农业科学院畜牧兽医研究所，山西太原 030032）

吕梁黑山羊是山西省特有的地方优良品种，也是我国珍贵的畜种资源，主要分布在吕梁山区一带，由于其抗寒、抗病、适应性强、易抓膘、肉质鲜嫩等特点，深受人们的喜爱。但由于多年来市场导向的变化及对地方品种重视不够，使得其品种资源受到严重威胁[1]。调查研究发现，纯种黑山羊数量正在急速锐减，而且已处于濒危或灭绝的边缘[2]，急需保护。传统的活畜保种方法成本高，受群体和个体生理利用年限制约，而体细胞保种占地小，且没有品种以及个体数量的限制，在长期保存种质资源研究中显示出独特的优势。目前，尚未见到在细胞水平上对吕梁黑山羊进行研究保护的相关报道。成纤维细胞在动物体内分布广泛，取材方便且易于培养，并具有高度遗传稳定性[3-6]。

本研究旨在通过保存吕梁黑山羊的耳成纤维细胞，实现吕梁黑山羊这一物种的遗传资源在细胞水平上的长期保存，以3月龄吕梁黑山羊耳组织为研究对象，利用组织块贴壁法分离培养吕梁黑山羊耳缘成纤维细胞，并尝试对获得的细胞进行电转染条件摸索，以期为后续吕梁黑山羊遗传资源保护与利用提供依据，及为开展相关生物技术研究如转基因克隆羊的制备提供试验材料。

1 材料和方法

1.1 试验材料

吕梁黑山羊（雄性3只，雌性3只）的耳缘组织采自岚县耀康农牧科技有限公司实验羊场。

DMEM购自Gibco公司；胎牛血清FBS购自Hyclone 公司；胰蛋白酶，NaHCO3，HEPES，DPBS，二甲基亚砜（DMSO），两性霉素 B，Hoechst 33342，0.4%Trypan blue，pEGFP-N1质粒购自Sigma公司，双抗为国产。细胞培养皿及24孔板购自Thermo公司。

1.2 试验方法

1.2.1 耳缘皮肤组织的采集及分离培养 先刮净黑山羊耳毛，拿采样钳剪取靠近耳尖约1 cm2大小的皮肤组织块，放入加有双抗的DMEM中，4 h内带回实验室。在超净工作台中将组织块彻底除净毛发，用消过毒的眼科剪除掉结缔组织并剪成1 mm2的小块，均匀接种到60 mm培养皿底部，倒置于37℃，5%CO2的培养箱中6～8 h，待组织块贴紧皿底后，加入DMEM细胞培养液（DMEM＋15%FBS＋1%双抗＋2.5 μg/mL两性霉素 B）4 mL，培养5～7 d观察细胞生长情况，待细胞长至80%时，进行下一步传代或冷冻保存。

1.2.2 细胞传代及成纤维细胞的纯化 当培养皿中细胞长至70%～80%时，弃掉原液，加入预热的0.25%的胰蛋白酶 1 mL，37℃作用 3～5 min，待80%的细胞变圆时，立即加入含有血清的DMEM培养液2 mL，并用枪头轻轻吹打皿底，之后收集细胞于15 mL的离心管中，1 500 r/min离心5 min，弃上清，重悬后接种至新的培养皿中，待细胞长满后，再次传代。细胞的纯化依据成纤维细胞对胰蛋白酶的敏感性高，脱壁快，而上皮细胞则敏感性差、脱壁慢。这样经过数次传代分离后只剩下纯的成纤维细胞。

1.2.3 细胞冻存及复苏 常规方法消化细胞，离心去上清后加入4℃预冷的冻存液（DMEM＋15%FBS＋10%DMSO），轻轻吹打混匀后，将悬液转入无菌冻存管中，封口后装入异丙醇冷冻盒中，冰箱-70℃过夜冷冻，第2天转入液氮保存。将细胞从液氮中取出后马上投入37℃水浴中，融解后转移至15 mL离心管中，并用10倍新鲜培养液稀释，1 500 r/min离心5 min，去除冷冻液中DMSO毒性，弃上清后用新鲜培养液培养。

1.2.4 细胞复苏后的活力测定 取复苏后的细胞悬液90 μL加10 μLTrypan blue，混匀后血球计数板计数，并计算细胞活率。

1.2.5 细胞生长曲线的绘制 将计数好的细胞以每孔1.0×104个接种到24孔板中培养，从接种开始，每24 h计数一次细胞密度，连续8 d计数，根据时间和细胞密度绘制细胞生长曲线。

1.2.6 细胞污染的检测 细菌的检测：将细胞用不添加抗生素的培养液培养3～4 d，观察培养液有无变浑浊或者变黄；真菌的检测：同样的方法培养细胞3～4 d，观察培养液有无出现云雾状或者纤维状菌丝体；病毒的检测：同样的方法观察有无出现蚀斑、空斑等现象；支原体检测：细胞用不添加抗生素的培养液培养3～4 d后，用固定液固定细胞10 min，室温下 Hoechst 33342染色 30 min，DPBS洗3次，然后于紫外光下观察，判断有无支原体污染。

1.2.7 转染试验 收集对数生长期的吕梁黑山羊成纤维细胞，PBS离心洗涤2次，细胞用无血清培养液重悬，并调整细胞密度为5×106个/mL。加入pEGFP-N1质粒10 μg，使每个样品总体积为0.4mL。混合均匀后转到4 mm电转杯中，4℃静置10min。然后分别以不同的电压（200，220，240，260 V），不同脉冲时间（10，15，20，25 ms），1 次脉冲进行电击。电击结束后，轻轻混匀细胞并迅速接种到35mm培养皿中。48 h后，根据绿色荧光蛋白表达情况来计算转染效率。

2 结果与分析

2.1 吕梁黑山羊原代成纤维细胞的形态学观察

培养6～7 d可观察到组织块边缘有极少量梭形、不规则三棱形的成纤维细胞爬出，同时还有上皮样细胞生长，没有组织块的区域则细胞密度极低，几乎没有细胞生长（图1-A）。培养至第12天时可明显看到有细胞沿组织块周边向外扩散，上皮细胞和成纤维细胞均有，二者间界限明显（图1-B），且成纤维细胞间间隙大，上皮细胞之间没有间隙。

2.2 传代细胞的形态学观察

传代后的细胞生长速度加快，细胞形态未发生明显变化，主要呈梭形、长条形、多角形或不规则形，当细胞长满汇合后呈漩涡状走形。成纤维细胞的纯化可根据其与上皮细胞对胰酶的敏感程度和传代后贴壁时间的不同，一般经过3～4次传代，细胞仅剩成纤维细胞。胰酶消化脱壁后的细胞形态如图2-A所示，传代后的细胞形态如图2-B所示。

2.3 细胞活力和贴壁率分析

本研究将传代后的第4～6代吕梁黑山羊成纤维细胞冷冻起来作为长期保存，共冻存细胞312管。随后将冻存180，360 d的第5代细胞进行复苏，复苏后平均活率分别为87.9%，83.2%，复苏的细胞在12 h左右就已经大量贴壁并呈梭形生长，培养24 h后，消化统计贴壁率分别为78.6%，74%。说明液氮长期冻存对细胞活力有一定影响，但是复苏培养一段时间后细胞生长状态良好，冻存不会对细胞造成永久损伤。

2.4 细胞生长曲线的绘制

连续8 d记数细胞密度并得到细胞生长曲线如图3所示。由图3可知，细胞生长曲线总体呈S型分布，符合标准的细胞生长曲线。刚接种的细胞由于胰蛋白酶消化损伤而生长缓慢，此期为细胞的适应阶段，从第2天开始细胞加速生长，进入对数生长期，第4～6天为细胞活性最佳时期，第6天以后进入平台期，细胞逐渐衰老直至死亡，因此，要在细胞进入平台期之前及时传代。

2.5 微生物污染检测结果

2.5.1 细菌、真菌及病毒检测结果 显微镜下观察培养的细胞，未见细胞培养液变浑浊，也无丝状物生长，没有观察到空斑、蚀斑现象，表明不存在细菌、真菌及病毒污染。

2.5.2 支原体检测结果 荧光显微镜下仅细胞核显示蓝色荧光，细胞周围没有发现荧光小点，无支原体污染。其结果如图4所示。

2.6 电转染条件摸索

本研究以常用的质粒载体pEGFP-N1为外源DNA，电转染吕梁黑山羊成纤维细胞，对电转染的电压和电击时间条件分别进行探讨，通过计算转染效率来摸索适合吕梁黑山羊成纤维细胞的转染条件。在电击时间相同情况下，电压为240 V时转染效率较高（图5）。在电压一定的情况下，脉冲时长为20 ms时的转染效率较高（图6）。

3 讨论

3.1 关于细胞培养

原代细胞的分离培养方法主要有胰蛋白酶消化法和组织块贴壁法[7]。胰蛋白酶消化法适用于软组织的分离，对较硬的纤维组织则消化效果差，且对细胞损伤较大[8]。组织块贴壁法操作简单，且不易污染，对细胞损伤小，是目前培养成纤维细胞的首选方法[9]。耳组织取材容易，又不会对动物造成伤害，是目前活细胞保种常用的材料，但由于耳组织中含有不利于细胞分散的胶原等成分，使原代细胞从组织块中游离出来所需时间变长，一般6～9 d才会有细胞爬出[10-13]。本研究原代培养时，先将组织块铺于培养皿皿底，倒置在培养箱中6～8 h，待组织块贴紧后加入培养液，培养7 d左右才有极少量细胞爬出，约20 d才能铺满皿底。原代细胞生长速度缓慢，可能与动物年龄和操作环节有很大关系[14]，如组织块在酒精中浸泡时间不宜超过30 s，浸泡时间稍长就会影响细胞从组织中游离出来的时间[15-17]。

3.2 关于细胞污染

细胞污染是细胞培养过程中最常见的问题，细胞一旦遭到污染，所有的试验结果都会变得毫无意义[18-19]。因此，能够及时检测并发现细胞是否污染至关重要。细菌污染容易检测，通过肉眼观察培养基颜色变化即可发现，受细菌污染的培养液变浑浊，细胞很快出现脱壁死亡，只要做好常规的消毒灭菌就可避免细菌污染，但无法彻底清除霉菌孢子，霉菌生长速度缓慢，一般在培养箱环境下培养96 h，才能肉眼观察到絮状的菌丝[20]，所以，很难及时发现。本研究在原代细胞培养过程中曾多次受到霉菌侵犯，主要与实验室环境潮湿有关。原代细胞生长周期长也增加了污染的概率。为防止细胞培养过程中发生污染，首先，试验操作必须遵守严格的无菌操作程序，试验用品须经过严格洗涤和灭菌程序处理，培养箱、超净工作台先用酒精擦拭后再开紫外杀菌[21-22]。其次，潮湿的实验室环境一定要注意霉菌清除。本研究采用过氧乙酸熏蒸加火焰灼烧法来清除环境中霉菌。另外，本研究发现在培养液中添加2.5 μg/mL两性霉素B能很好的抑制霉菌污染。

3.3 转染

转染作为检测细胞状态的一个有效方法，能间接地评价建立的细胞系成功与否。电转染是一种简单、重复性好且高效的转染方法[23]。不同动物、不同类型的细胞所需的电转染条件不同[24]，因此，本研究通过电转染pEGFP-N1质粒到吕梁黑山羊成纤维细胞来筛选出合适吕梁黑山羊成纤维细胞的电转染条件。结果显示，电压240 V，脉冲时长20 ms，1次脉冲的条件下，转染效率较高。本研究只考虑了不同参数对转染效率的影响，而未考虑电转后细胞存活率，下一步将结合电转后细胞死亡率优化电转条件，为以后转基因克隆的研究提供依据。