郑婷婷，李 磊，徐 敏，王美琴

（山西农业大学农学院，山西太谷 030801）

近年来，随着人们对食品安全、环境污染及生态平衡等一系列问题的重视，减少化肥和农药的使用，研制和开发微生物菌肥及生防菌剂已成为植保界和农药界共同关注的热点[1]。微生物菌剂按照有效成分的不同，可分为细菌类、真菌类和病毒类，其中，细菌类微生物菌剂主要是以芽孢杆菌为有效成分[2-4]。芽孢杆菌（Bacillus spp.）能够形成具有耐热、耐旱、抗紫外线的芽孢且易于繁殖，对不良环境具有很强抵抗力，还可以分泌抗生素、抗菌蛋白和多肽类等多种抗菌活性物质，不仅可以杀死植物病原物，还能诱导植物产生抗病性，从而成为生防菌剂的良好材料[5-7]。据相关报道，在我国，科研工作者对具有生防作用的芽孢杆菌进行了广泛研究，如张荣胜等[8]筛选到1株解淀粉芽孢杆菌Lx-11，对细菌性条斑病菌的田间防效达60.2%，显著高于化学药剂20%叶枯唑防效；王奕文等[9]从甜瓜表面分离到1株解淀粉芽孢杆菌，对灰葡萄孢、链格孢和尖孢镰刀菌等8种果蔬病原真菌具有广谱的拮抗作用。在美国，Agraquest公司开发的活菌杀菌剂 Serenade TM和Sonata AS，可防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的白粉病、霜霉病、疫病、灰霉病等病害。澳大利亚开发的Bacillus subtilis A-13对麦类和胡萝卜立枯病以及其他土传病害具有很好的防治和增产作用[10]。但是，目前对芽孢杆菌的研究仍主要集中在室内生防菌株的鉴定与筛选、抑菌试验、促生作用、发酵条件及抑菌机理等方面，真正运用在实践当中并登记的生防菌剂还很少[11]。

生防菌剂的剂型较多的是可湿性粉剂、悬浮剂及颗粒剂，其中，乳悬剂为悬浮剂中的一种，是以溶剂油为主要成分，添加不同的助剂，如乳化剂、抗生素、防冻剂等，加工制成高效无公害、性质稳定、对人和环境安全的微生物农药制剂[12-13]。山西农业大学农学院植物病害与生物防治课题组前期筛选鉴定出1株核桃内生解淀粉芽孢杆菌（B.amylol-iquefaciens）Ht-q6（专利号：ZL 201410469787.6），室内研究证明，该菌株抑菌谱广、易在植物体内定殖及作用稳定，具有开发研制生防菌剂的潜力[14]。

本试验以Ht-q6菌株为材料，以目前生产上危害严重的番茄早疫病菌为指示菌，通过助剂的筛选，按照国家质量标准，研制出生防菌Ht-q6乳悬剂，旨在为生产上开发应用提供资源。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试菌株为生防菌Ht-q6和番茄早疫病菌（Alternaria solani），均由山西农业大学植物病理实验室提供。

1.2 试剂和培养基

溶剂油为芥末油、花椒油、芝麻油、花生油、胡麻油。乳化剂为吐温-80和OP-10。抗生素为两性霉素、灰黄霉素、制霉菌素。防冻剂为氯化钙、乙醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇。润湿剂为十二烷基苯磺酸钠，洗衣粉，D-317，DCM-82。稳定剂为 CaCO3，K2HPO4，KH2PO4，CHC-Na。保护剂为抗坏血酸、羧甲基纤维素、糊精、荧光增白剂。培养基为NA培养基、NB培养基、PDA培养基。

1.3 试验方法

1.3.1 生防菌Ht-q6发酵液的制备 用接种环挑取生防菌Ht-q6，通过平板划线培养法，将其接种于NA平板上进行活化培养24 h，然后将活化菌株接种到100 mLNB培养液中，接种量1%，置于摇床上，以30℃，180 r/min速度振荡培养72 h，芽孢率≥90%。

1.3.2 番茄早疫病菌芽孢悬浮液的制备 取番茄早疫病菌接种在PDA平板上，将其置于26℃恒温培养箱中培养7 d后，用无菌刀把培养物切成5 mm×5 mm的菌块，接入水琼脂培养液中，黑暗放置3 d后产生大量分生孢子，用无菌水稀释振荡均匀，得到浓度为106cfu/mL的孢子悬浮液[15]。

1.3.3 生防菌Ht-q6乳悬剂助剂筛选

1.3.3.1 溶剂油和乳化剂的筛选[16]溶剂油：取1 mL生防菌Ht-q6发酵液分别加入到10 mL不同的溶剂油中，置于小锥形瓶内，密封后室温下贮存，并定期取0.1 mL加入到10 mL的NB培养液中，测定其芽孢存活率。

乳化剂：将选出的最佳溶剂油取10 mL置于小锥形瓶中，分别加入1 mL的吐温-80，OP-10及吐温-80和OP-10（体积比为1∶1）的混合物，再向其中加入1 mL的发酵液，振荡均匀后，测定芽孢存活率。每隔7 d取0.1 mL分别加入到10 mL不同浓度的最佳乳化剂中，振荡均匀后测定芽孢存活率。

以上各处理均在（25±1）℃下摇床振荡培养，每个处理重复3次，用平板菌落计数法测定并记录不同时间芽孢存活率，以芽孢存活率的高低判定溶剂油优劣以及测定不同乳化剂对芽孢活性的影响。

1.3.3.2 抗生素的筛选 将已经筛选出的溶剂油和乳化剂的最佳配比与生防菌Ht-q6发酵液混合制成乳液，然后将不同抗生素按照质量浓度为5，15，25，50 μg/mL加到乳液中。将番茄早疫病菌孢子悬浮液均匀涂布在PDA平板上，自然晾干后在平板中央打一直径为5 mm的孔。用移液枪取5 μL上述处理的乳液于孔中，每个处理3次重复，以不加抗生素的乳液作为对照。将所有平板置于（25±1）℃的恒温培养箱中培养4 d后，测量抑菌圈直径。

1.3.3.3 防冻剂的筛选 取1 mL不同防冻剂分别加入到10 mL生防菌Ht-q6发酵液中充分混合，稀释后取0.5 mL均匀涂布于NA平板上，以不加防冻剂的发酵液为对照组，每个处理3次重复。置于恒温培养箱中（25±1）℃下培养，3 d后采用平板菌落计数法测定芽孢存活率，筛选最佳防冻剂。将筛选出的防冻剂，按2%，4%，6%，8%和10%等5种浓度分别与发酵液10 mL混合，以蒸馏水为对照，对照组始终置于（25±1）℃的恒温培养箱中培养，各处理前24 h置于（0±1）℃的恒温培养箱中，24 h后与对照组的培养条件一致，培养3 d后记录芽孢存活率，筛选出最佳防冻剂浓度。

1.3.3.4 润湿剂和稳定剂的筛选 将4种润湿剂（10%）和4种稳定剂（2%）分别添加到已经筛选出的上述配方中，测定添加润湿剂和稳定剂后的悬浮率、润湿时间和芽孢存活率，每个处理3次重复，以不加润湿剂和稳定剂的配方为对照，筛选出最佳润湿剂和稳定剂。

1.3.3.5 保护剂的筛选[17]将4种保护剂按10%分别加到已制备的乳悬剂中，测定添加保护剂的悬浮率、润湿时间，以不加保护剂为对照，在254 nm紫外灯下距离40 cm处照射6，12，24 h后计算芽孢存活率。

1.3.4 生防菌Ht-q6乳悬剂贮藏时间的测定 取2 mL试样和18 mL的无菌水置于100 mL的锥形瓶内，振荡均匀。采用平板菌落计数法测定活菌数，每隔6 d测1次，当活菌数出现大量减少时，改为每隔3 d测一次，直到活菌数接近于零，记录测量间隔时间及活菌数。根据稀释倍数计算出1 mL样品中的活菌数。

1.3.5 生防菌Ht-q6芽孢存活率的测定 参考《中华人民共和国农业部标准》（GB 4789.2—2010），采用平板菌落计数法，测定制剂的芽胞含量。即将乳悬剂按10倍梯度依次稀释7次后，取最后稀释液0.1 mL均匀涂布于平板上，计算菌落数。根据公式计算菌株存活率（SC）。

其中，M为含生防菌的乳悬剂在NA平板上的菌落数（cfu/g）；M0表示未添加任何助剂的生防菌在NA平板上的菌落数（cfu/g），即空白对照。

1.3.6 生防菌Ht-q6乳悬剂质量指标的测定 按照《中华人民共和国国家标准》对生防菌Ht-q6乳悬剂的各项质量指标进行测定，如倾倒性、热贮稳定性、低温稳定性、杂菌率、pH和细度。

倾倒性的测定按HG/T2467.5—2003方法。热稳定性的测定按GB/T 19136—2003方法。低温稳定性的测定按GB/T 19137—2003方法。悬浮率的测定按照GB/T 14825—2006方法；pH值测定按照GB/T1601—1993方法。

1.3.7 生防菌Ht-q6乳悬剂安全性评价

1.3.7.1 对番茄植株的安全性测定 用接种针蘸取生防菌Ht-q6乳悬剂10倍稀释液直接穿刺接种番茄叶片和茎部，保湿培养，以穿刺接种无菌水作为对照。然后将番茄苗的根部洗净，浸根于菌悬液中接种，再将番茄苗移栽至含无菌土的育苗钵中，常规管理；以根部浸于无菌水为对照，每个处理5株番茄（5～6片叶），3次重复。

1.3.7.2 毒理学测定 依据国家安全标准GB/T 15670.2—2017，以大鼠为材料，通过急性经口毒性、急性经皮毒性和急性皮肤刺激试验，测试生防菌Ht-q6乳悬剂对大鼠的安全性[18]。

2 结果与分析

2.1 溶剂油与乳化剂的筛选结果

从表1可以看出，芥末油在21 d后芽孢存活率为0，效果最差。花生油处理的芽孢存活率与其他处理相比，仅在7，14 d时与芝麻油处理的差异不显著，其余时间段与其他处理间差异显著。故确定花生油为最佳溶剂油。

表1 室温下不同溶剂油对芽孢存活率的影响

从表2可看出，14 d之前芽孢存活率在66%～100%，其中，OP-10对芽孢的存活率影响最低，与其他处理差异显著。14 d之后吐温-80与OP-10混合乳化剂对芽孢存活率的影响减小，与其他处理相比差异显著，确定选择该混合物作为乳化剂。由图1可知，芽孢存活率随乳化剂添加比例的升高而降低，确定0.2%为混合乳化剂的最佳添加比例。

表2 室温下不同乳化剂对芽孢存活率的影响

2.2 抗生素的筛选

由表3可知，随着3种抗生素质量浓度的增加，对番茄早疫病菌抑制作用逐渐增强。其中，加入15 μg/mL的制霉菌素和两性霉素，对番茄早疫病菌抑制作用较好且与对照差异不显著，当质量浓度继续增加时，对乳液的抑菌效果有增效作用。考虑到价格和用量问题，最终确定15 μg/mL的制霉菌素添加于生防菌Ht-q6乳悬剂中。

2.3 防冻剂的筛选

由图2可知，添加丙二醇和丙三醇的处理，芽孢存活率分别为12.2%和19.4%，与其他处理相比具有显著性差异；氯化钙、乙醇和乙二醇与对照相比，对芽孢存活率的影响较小。由此得出，氯化钙、乙醇和乙二醇适合作为防冻剂。

从表4可以看出，当防冻剂浓度小于6%时，随防冻剂浓度的增加对芽孢的保护作用逐渐增强，当乙二醇浓度为6%时，芽孢存活率最高，达到85.4%，与其他处理差异显著，但与对照差异不显著。因此，确定6%的乙二醇作为乳悬剂的防冻剂。

表4 防冻剂对芽孢的保护作用

2.4 润湿剂、稳定剂的筛选

从表5可以看出，十二烷基苯磺酸钠的悬浮率为65.6%，与其他处理相比差异显著；润湿时间为28.5 s与洗衣粉差异不显著并且芽孢存活率最高，为89.1%。在田间润湿时间越短越能发挥药效，最终确定十二烷基苯磺酸钠作为乳悬剂的润湿剂。

表5 润湿剂对Ht-q6乳悬剂的影响

从表6可以看出，KH2PO4的悬浮率为77.6%，与其他处理相比差异显著，润湿时间为41.4 s，与K2HPO4差异不显著。综合分析润湿时间以及对芽孢存活率的影响，选择效果最佳的KH2PO4为稳定剂。

表6 稳定剂对Ht-q6乳悬剂的影响

2.5 保护剂的筛选

由表7可知，抗坏血酸的悬浮率为76.2%，润湿时间为（37.4±1.8）d，与其他处理间差异显著，悬浮效果与润湿性能最好；抑菌圈直径与对照组差异不显著且添加抗坏血酸后对芽孢活性影响小，确定最佳紫外保护剂为抗坏血酸。

2.6 生防菌Ht-q6乳悬剂质量检测结果分析

制剂外观为可流动的乳白色黏稠液体；贮存过程中有少量沉淀或微分层，经摇动能恢复原状，无结块。由表8可知，出生防菌Ht-q6乳悬剂的芽孢含量为2.54×109cfu/mL，杂菌率为0.85%，pH值为7.2，细度为96.5%，悬浮率为90.5%，倾倒性、低温稳定性和热贮稳定性都符合国家标准值，质量合格。

表7 4种紫外保护剂对Ht-q6乳悬剂的影响

表8 生防菌Ht-q6乳悬剂质量检测结果

2.7 生防菌Ht-q6乳悬剂贮藏时间的测定结果分析

从图3可以看出，生防菌Ht-q6乳悬剂的活菌量在贮藏前54天时变化不明显，减少幅度较小，从54 d开始活菌量变化幅度增大，当贮藏80 d时含量接近于零，说明乳悬剂的有效贮藏时间为80 d左右，而在54 d之内使用效果最佳。

2.8 生防菌Ht-q6乳悬剂安全性测定结果

2.8.1 乳悬剂对番茄植株的安全性测定 结果表明，番茄叶片和茎秆用接种针穿刺接种培养3 d后，与对照组没有明显差异，番茄植株经乳悬剂100倍稀释液多次浇灌后，无发病状况。确定生防菌Ht-q6乳悬剂对番茄植株没有致病性。

2.8.2 乳悬剂毒理学测定 急性经口毒性和急性经皮毒性测试表明，该乳悬剂属于低毒性。在急性皮肤刺激试验周期内，试验鼠的皮肤涂抹部位未出现红斑、水肿，表明乳悬剂对皮肤没有刺激性。

3 结论与讨论

本试验通过对溶剂油、乳化剂、防冻剂和抗生素等助剂的筛选，确定了生防菌Ht-q6乳悬剂的最佳配方。经检测，制剂的各项质量指标达到国家要求，毒性测试表明该乳悬剂属于低毒性，产品配方成本经济，加工工艺简单，质量稳定，为其他生防菌剂助剂的开发提供了参考。由于乳悬剂在农药制剂中发展历史较短，并处于不断完善中，故在产量上仍远远低于乳油和可湿性粉剂[19]。

与发达国家相比，我国乳悬剂的研究技术仍然存在很多问题，农药生产企业的自主研发能力较弱，国内现行产品标准中许多技术指标与国外现行产品存在较大差距。如国内的悬浮率在85%以上，而国外一般达到95%以上。这直接影响了制剂的储存时间，同样也是阻碍此剂型推广应用的一大技术性难题[20]。本试验制备的乳悬剂有效贮藏时间（约80 d）与其他芽孢杆菌生防菌剂的有效贮藏时间（约100 d）相比有些短。因此，为了保持制剂防效和提高贮藏时间，在制备乳悬剂时还需要不断调整制剂中所添加的助剂种类及范围。如李农昌等[21]在对白僵菌油剂剂型的研究中还分别对抗氧剂、增效剂、稀释剂进行筛选。此配方的实用性有待田间试验证实。