赵庆英，杨俊鸾，李旭凯，杨致荣

（1.山西农业大学文理学院，山西太谷 030801；2.山西省林木育种研究中心，山西太原 030031；3.山西农业大学生命科学学院，山西太谷 030801）

棉花是世界上重要的纤维作物之一[1]，具有重要的经济地位，但是我国棉花纤维品质较差，提高棉花纤维的品质是目前棉花研究中的一个重要目标[2-3]。棉花纤维的长度、强度、伸长率等性状决定其品质，而这些性状主要由基因型控制。研究与棉花纤维发育相关基因的表达调控，对棉花纤维品质的改良具有重要的意义[4]。

纤维素是由D-吡喃葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接而成的聚合物，是植物、藻类、卵菌细胞壁以及细菌生物膜的主要组成成分[5]。β-1，4-内切葡聚糖酶在植物中有多个成员，统称为GH9家族，该家族在纤维素的合成与组装过程中起着重要的作用。GH9酶参与纤维小体的组装，能够有效地降解纤维素和植物细胞壁多糖[6]，在高等植物中，GH9基因在细胞壁的生物合成、修饰、重塑和降解中起着重要作用，包括细胞的伸长和分化、胞质分裂、器官脱落和果实成熟[7-8]。另外，β-1，4-内切葡聚糖酶还参与了果实催熟和器官脱落过程中木质素的转变，并且可以诱导纤维素的从头合成[9]。

GH9家族包括A，B，C共3个亚类，GH9A包括一段跨膜结构、催化结构和N-末端延伸结构。GH9B是一类具有催化结构和信号肽的分泌蛋白。GH9C具有催化结构、信号肽以及C端的纤维素结合结构域（Cellulose bindingmodule，CBM），CBM可以结合到晶体纤维素上，通过催化结构域可以水解人造纤维素聚合酶以及多种植物细胞壁多糖[8，10]。但是，并不是所有物种都符合这种典型结构。

在拟南芥中，编码GH9A蛋白的基因有KORRIGAN（KOR），KOR2，和 KOR3[8]共 3 个。拟南芥kor-1突变体下胚轴变短，KOR突变导致细胞板畸变、细胞壁不完整和多核细胞的形成，幼苗和成苗变矮，幼苗形态的严重异常以及顶端分生组织以外的所有细胞的伸长受到一定的抑制[11]。KOR缺失突变体植株矮小，纤维素-木葡聚糖网络发生改变，说明GH9A成员在纤维素的正确组装过程中是必需的[9]。

在水稻中，OsGH9A3和B5与纤维素生物合成基因OsCESA1，OsCESA3和OsCESA8具有极高的共表达，表明OsGH9A3和B5基因在初生细胞壁纤维素的合成过程中起作用[7]；在杨树中，PtrKOR与PtrCesA1，PtrCesA2和PtrCesA3基因的共表达对于高度结晶的木质纤维素的合成非常重要[12]。

B亚类的CEL1（At1g70710）在生长的幼嫩组织，尤其在木质部细胞壁增厚过程中具有很高的活性，cel1突变体茎的机械强度减弱，纤维素和木质素的含量显著降低[8]。微阵列研究表明，B类糖苷水解酶具有许多潜在的功能，包括At1g22880，At2g44570和At2g32990的上调响应IAA作用，At4g39000在雄蕊、雌蕊、种子和胚珠中具有高水平表达[8]。在水稻中，OsGH9B1，OsGH9B3和OsGH9B16基因对木质纤维素结晶度具有修饰作用，GH9Bs则具有降低纤维素结晶度的酶活性，GH9B酶在微纤丝表面产生非结晶纤维素时具有活性[7，13]。OsGH9B8，OsGH9B9，OsGH9B10和OsGH9B11基因与典型的次生细胞壁生物合成的 OsCESA4，OsCESA7和OsCESA9基因共表达，说明其在次生细胞壁合成过程中起作用[14]。

在拟南芥中，GH9C表达下调将导致根毛形成和生长过程中细胞壁的弱化，GH9家族的亚类A和C也已知在纤维素生物合成中相互作用[15]。反向遗传学方法证实了杨树类GH9C成员在调节纤维素结晶度和参与细胞生长过程中具有重要作用。

糖苷水解酶GH9基因家族在拟南芥、水稻等模式植物中的研究较为清楚，但是对其在棉花中的作用机制仍不清楚。

本试验通过对糖苷水解酶GH9基因家族进行生物信息学分析，旨在为其在棉花中作用机制的深入研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 系统发育树的构建

利用hmmer[16-17]软件中的hmmsrarch从拟南芥、水稻、玉米、棉花基因组数据中获得糖苷水解酶GH9基因家族蛋白序列，并运用MEGA 7.0[18]软件采用邻位相连法（Neibor-joining）进行聚类分析构建基因系统发育树，分析参数选择默认值。

1.2 蛋白保守序列分析

通过MEME[19]（http://meme-suite.org/tools/meme）在线分析棉花、水稻以及拟南芥等物种GH9家族成员氨基酸序列的保守序列，保守位点宽度设置为6，最大保守序列鉴定数目设置为10。

1.3 蛋白三级结构预测

利用SWISS-MODEL[20-22]对GH9基因蛋白质三维结构进行建模，建模过程中选择与提交的目标序列相似度大于25%的模板。

1.4 基因表达热谱图的构建

利用R[23]软件的heatmap函数制作基因表达热谱图。

2 结果与分析

2.1 棉花GH9家族系统进化分析

对棉花、拟南芥、水稻和玉米GH9家族成员构建系统发育树，以期揭示不同物种GH9家族成员系统进化关系。棉花、拟南芥、水稻和玉米GH9不同家族成员可以分为GH9A，GH9B和GH9C共3个亚类，同一亚类成员之间发挥相同或相似的功能。由系统进化树可知（图1），3个亚家族没有明显地分为3支，可能与糖苷水解酶的结构域的保守性有关。GH9B和GH9C都具有信号肽序列，又具有GH9A和GH9C所具有的催化结构，因此，GH9B既能够与GH9A分为一支[24]，又能与GH9C分为一支。棉花与拟南芥的亲缘关系最近，而与水稻和玉米的亲缘关系较远，这是因为棉花和拟南芥同为双子叶植物，而水稻和玉米是单子叶植物。

2.2 棉花GH9A保守结构域分析

表1 不同物种间GH9A蛋白保守模块

GH9A主要位于质膜，具有一段跨膜结构，对其同一物种不同基因及其不同物种之间的保守序列分析，并对棉花、拟南芥、二穗短柄草、大桉、玉米、水稻、蒺藜苜蓿、杨树、小立碗藓、高粱和卷柏物种的GH9A家族跨膜区比较，结果发现，他们均具有显著的序列同源区域，具有一段含有22个氨基酸残基（表 1）的保守序列 X8GCX12（图 2），说明GH9A的跨膜区在物种进化过程中具有保守性。

2.3 GH9C保守结构域分析

GH9C一般具有一个纤维素结合结构域（Cellulose binding module，CBM），GH9C 催化活性的多样性依赖于CBM的类型，对结晶纤维素的有效降解是必须的。CBM_2，CBM_3，CBM_4_9以及 CBM_10均存在于微生物中[25]，具有一定的保守性，不同的CBM家族保守性不同（图3），这可能与CBM家族功能的多样性有关。CBM_2家族来源于细菌，具有一段保守序列，在进化过程中保守性很强，其功能比较稳定，其中，Trp17对CBM_2与纤维素的结合非常重要，能够加强催化结构域的降解能力，在分解结晶纤维素过程中扮演着重要的角色。CBM49存在于整个植物界中，与CBM_2家族最相似，存在一个保守的色氨酸残基，表明植物中的CBM49可能与 CBM_2 具有相似的作用[8，26]。

2.4 棉花GH9催化结构域蛋白质三维结构

氨基酸序列决定蛋白质构象，许多相似的序列可以决定相同的构象。利用SwissModel（http://swissmodel.expasy.org/）在线预测GhGH9A1蛋白质的三级结构。图中黑框标注部分为催化结构域（图4），它在细胞壁的生物合成、重塑和降解中发挥作用。

2.5 GH9基因在棉花中的共表达分析

对棉花数据库中检索到的49个GH9基因在11个不同组织中的共表达进行分析，结果发现（图5），Gh_D05G1785，Gh_A05G1599，Gh_A08G0869，Gh_D10G0789，Gh_A10G0610，Gh_D01G1428，Gh_A12G0382，Gh_D05G2628，Gh_D12G2309，Gh_D11G 1570，Gh_A11G1419以及Gh_D08G1224基因在叶片中表达量较高，可能与叶片中细胞壁的形成有关。Gh_A07G0348和Gh_D11G1785在花瓣中表达量很高，可能与棉花纤维合成有关。Gh_D12G1280，Gh_D07G0410，Gh_A06G1152，Gh_D06G0838，Gh_A06G0721，Gh_A08G2210和 Gh_D08G2576在花药中高度表达，Gh_A03G1043，Gh_A02G0972，Gh_D03 G0779，Gh_D03G0738，Gh_A11G1030 和 Gh_D11G 1186在柱头中高度表达，可能与受精过程有关。Gh_A02G1770，Gh_A07G0769，Gh_D13G0296和Gh_A13G0277在种子中的表达量很高，可能在种子成熟过程中发挥作用。

3 讨论

糖苷水解酶GH9基因家族在纤维素的合成与修饰、细胞壁的形成、器官生长以及果实脱落等过程中发挥着重要的作用。通过对棉花GH9家族进行生物信息学分析，解析其基因组特征可为后续深入研究GH9基因家族的功能奠定基础，对于研究纤维素的生物合成与降解具有重要的意义。

本研究通过生物信息学分析发现，棉花与同属于双子叶的拟南芥GH9基因家族亲缘关系最近，与单子叶植物水稻和玉米的亲缘关系较远。棉花、水稻、拟南芥及杨树等物种的GH9A跨膜结构域均具有一段保守基序，这可能与其功能的相似性有关。GH9C的纤维素结合结构域CBM49具有一个保守的色氨酸残基，可能在纤维素降解过程中起作用。

通过对棉花GH9基因家族的共表达分析发现，A亚类Gh_D10G0789，Gh_A10G0610基因在叶片中表达量较高，Gh_D06G1285，Gh_A06G2111基因在开花20 d后的纤维中表达量最高。C亚类的Gh_D10G0789，Gh_A10G0610基因在叶片中表达量较高，Gh_D12G2309在茎中表达量较高，Gh_A02G 1000，Gh_A12G2130基因在开花10 d后的纤维中具有较高的表达量，Gh_D03G0738在柱头中表达量较高。B亚类在各个组织中均有表达，说明B亚类在棉花发育过程中的功能具有多样性。棉花GH9基因在各器官中的表达已经有了初步的分析，但是这个基因家族各成员在棉花发育过程中的具体功能尚不清楚，以上的分析结果能够为之后研究糖苷水解酶对纤维素的分解、细胞壁的合成及降解的作用机制提供一定的理论基础。