孙小玉，刘金娜,2，周 蒙，郭 杰，丁亭乐，张存莉

(1.西北农林科技大学化学与药学院，陕西杨凌 712100；2.杨凌职业技术学院药物与化工分院，陕西杨凌 712100)

油菜素甾醇类化合物(brassinosteroids，简称BRs)是一类多羟基甾体类化合物，主要由A、B、C、D四个环和侧链组成，其中B环可以是六元环或者是一个含氧内酯环。至今已发现80余种BRs，可参与植物整个生长发育进程的调控[1]，促进细胞的伸长、叶的偏上性、木质部的分化、光的形态学建成等，还调控其他五大激素的平衡[2]，对提高作物的产量和品质[3]、增强植物的抗逆性[4]、减缓重金属对植物的毒害[5]、增强农药在植物体内的降解和代谢[6]等具有一定作用。BRs还表现出一定的药用效果，具有抗氧化、抗菌、抗癌及一定的神经保护功能等，还可降低血液内的胆固醇[7-9]。

目前，在作物上使用的BRs主要为八仙丰产素(24-表油菜素内酯)和云大-120(28-表高油菜素内酯)。两者价格较高，且作用时间短，需要反复喷施才能产生一定效果。因此，探寻结构稳定、效果显著且廉价的植物生长调节剂一直备受关注。

拉肖皂苷元(LA)是从药用植物黑刺菝葜(Smilaxscobinicaulis)中分离得到的一种6-酮型的螺甾类化合物，其结构与栗甾酮、茶甾酮等具有相同的3-羟基和6-羰基活性官能团[10]，并表现出类似BRs的活性，其相关的生理效应已在玉米、油菜等作物上得到证实[11-12]。目前，有关LA的研究多集中在其药理活性和合成方法的研究上[13-15]，有关其对小麦的生理学效应研究较少。

本试验以冬小麦品种小偃22为材料，研究LA浸种对小麦种子萌发和幼苗生长的影响，以明确LA的生物学效应，为其开发及在小麦上的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试小麦品种为小偃22，由国家小麦改良中心杨凌分中心提供；LA(纯度≥99.6%)由本课题组按照张存莉等[10]方法制备。

1.2 试验方法

1.2.1 种子处理

选取大小均匀、籽粒饱满的小麦种子置于10% H2O2中消毒5 min，用蒸馏水冲洗6次，滤纸吸干水后，将其避光浸在不同浓度的LA(0、0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5 mg·L-1)溶液中，25 ℃下保持12 h；浸种结束后，用蒸馏水洗涤种子3次，多余水分用滤纸吸去。

1.2.2 发芽相关指标测定

将LA浸种处理后小麦种子每50粒均匀排放在铺有3层滤纸的培养皿(9 cm)中，于25 ℃黑暗培养，相对湿度控制在80%以上，每个处理重复3次，用清水作为对照(CK)。

以种子胚根突破种皮记为种子发芽，每天记录发芽的种子数，连续记录7 d，计算其发芽率、发芽指数和发芽势。

发芽率(GP)=n/N(n为7 d内能正常发芽的种子数，N为供试种子总数)

发芽势(GE)=ni/N(ni为发芽高峰时期的发芽种子数，N为供试种子总数)

发芽指数(GI)= ∑(Gt/Dt) (Gt是第t天的发芽数，Dt为相应的发芽时间)。

1.2.3 苗期相关指标测定

将不同浓度LA浸种处理的小麦种子于培养箱中25 ℃避光催芽，每个处理选择露白一致的小麦种子60粒，放入盛有1/2 Hoagland培养液的塑料盘中，25 ℃、光暗比12/12、光照强度为400 μmol·m-2·s-1条件下培养，定期通气。7 d后，每个处理随机选取30株小麦幼苗，测定苗高、根长、第一片真叶长、干重和鲜重；待到幼苗生长至两叶一心期时，随机选出20株测定相关生理指标。

超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)的活性参照孙 群[16]的方法测定，其中，POD以每分钟内A470变化0.01为一个酶活性单位，CAT以每分钟内A240减少0.01为一个酶活性单位。丙二醛(MDA)含量的测定采用硫代巴比妥酸比色法[17]；根系活力的测定采用氯化三苯基四氮唑(TTC)还原法；叶片含水量的测定采用烘干法；叶绿素含量的测定采用分光光度法[18]；可溶性糖、可溶性蛋白及游离脯氨酸含量的测定参考高俊峰[17]的方法。

1.3 数据处理

采用SPSS 19.0进行数据统计分析、Duncan新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 LA对小麦种子萌发的影响

由表1可知，随着LA浓度的升高，小麦的发芽率、发芽指数和发芽势均呈逐渐降低趋势；0.5 mg·L-1LA浸种处理较对照(CK)显著降低了小麦种子的发芽率、发芽势和发芽指数，其他浓度LA处理均较CK显著提高了小麦的发芽率、发芽指数和发芽势(0.1 mg·L-1LA浸种的发芽指数除外)，其中，以0.001 mg·L-1处理的小麦种子发芽率、发芽势和发芽指数最高，分别较CK提高了13.13%、214.81%和55.17%，且显著高于其他处理，说明适宜浓度LA浸种可促进小麦种子的萌发，过高浓度则产生抑制作用。

表1 不同浓度LA浸种对小麦种子萌发的影响Table 1 Effect of different LA concentration on seed germination

同列数值后不同字母表示处理间差异在0.05水平上显著。下表同。

Different letters after the values in the same columns mean significant differences among the treatments at the 0.05 level.The same in other tables.

2.2 LA对小麦幼苗生长的影响

由表2可知，与CK相比，0.001～0.05 mg·L-1LA浸种处理可显著增加小麦的株高、根长、真叶长和苗干重。本试验条件下，0.001 mg·L-1LA浸种，小麦幼苗的株高、苗鲜重和苗干重最高，分别为9.80±0.35 cm、1.05±0.06 g和0.20±0.002 g，比CK提高了26.53%，32.91%和122.22%；0.005 mg·L-1LA浸种后，小麦幼苗的根长和真叶长最大，可达16.53±0.12 cm和5.87±0.29 cm，分别比CK提高了92.21%和46.75%。

2.3 LA对小麦幼苗生理指标的影响

2.3.1 LA浸种对小麦幼苗根系活力、叶片含水量和叶绿素含量的影响

由表3可知，随着LA浸种浓度的提高，小麦幼苗的根系活力、叶片含水量以及叶绿素含量呈先增后降的趋势；0.01 mg·L-1LA浸种处理下根活力和叶片含水量显著高于其他处理，分别较CK提高了58.92%和9.21%；叶绿素在0.005 mg·L-1LA浸种处理下含量最高，为2.49 mg·g-1FW，比CK提高了39.11%，差异显著，但与0.01 mg·L-1LA处理差异不显著。

表2 不同浓度LA浸种对小麦幼苗生长的影响Table 2 Effects of different LA concentration treatments on growth of wheat seedlings

2.3.2 LA对抗氧化酶活性和MDA含量的影响

从表4可见，与CK比较，0.01～0.05 mg·L-1LA浸种可使小麦幼苗叶片的SOD、POD、CAT活性显著增加(0.01和0.05 mg·L-1处理POD除外)，MDA含量显著降低；但当LA浓度为0.5 mg·L-1时，抗氧化物酶活性降低，MDA含量升高。7个处理中，以0.001 mg·L-1LA浸种处理的小麦叶片抗氧化物酶活性以及MDA含量降低程度最大，其中，SOD、POD和CAT活性分别较CK提高了39.43%、136.62%和60.42%，与其他处理差异显著，MDA含量降低60.49%。

表3 不同浓度LA浸种对小麦幼苗根系活力、叶片含水量和叶绿素含量的影响Table 3 Effect of different LA concentration on root vigor,leaf water content,chlorophyll content of wheat seedlings

表4 不同浓度LA浸种对小麦幼苗叶片抗氧化酶活性和丙二醛含量的影响Table 4 Effect of different LA concentration on antioxidant enzyme activity and MDA content in leaves of wheat seedling

表5 不同浓度LA浸种对小麦幼苗叶片渗透调节物质的影响Table 5 Effect of different LA concentration on the content of osmotic regulation substances in leaves of wheat seedling

2.3.3 LA浸种对小麦幼苗叶片中渗透调节物质含量的影响

由表5可知，随着LA浓度的增加，小麦幼苗叶片可溶性糖、可溶性蛋白、游离脯氨酸含量呈先增后减的趋势，其中0.005 mg·L-1LA浸种效果最佳，可分别使可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸含量较CK提高70.74%、32.12%和34.47%，差异显著。

3 讨 论

3.1 LA浸种处理对小麦种子萌发的影响

出苗速度快、整齐，有利于作物增产。种子的萌发除了受到光、温、水等外界环境的影响，还受种子活力、种子寿命以及激素水平等内在因素的影响。本试验结果显示，适宜浓度LA浸种可显著提高小麦的发芽势、发芽率和发芽指数。Anuradha等[19]报道，24-BR显著提高干旱胁迫下萝卜种子的发芽率，解除盐胁迫对水稻发芽的抑制。研究表明，BR促进萌发的原因是其可以调控种子内ABA的降解[20]。LA是一种具有类似BRs生理效应的螺甾类化合物，其促进小麦种子的萌发和幼苗的生长可能是由于LA也能通过影响植物体内激素水平进而影响植物的萌发和生长。

3.2 LA浸种处理对小麦幼苗的生长及生理特性的影响

植物幼苗的生长状况与产量密切相关。植物根系作为吸收水分和营养物质并进行物质转化与运输的重要器官，其生长状况直接影响地上部物质积累和形态建成。巩文秀等[21]报道，LA的糖衍生物浸种可以促进小麦根的生长，提高根系活力，进而增强小麦幼苗对水分和营养物质的吸收，提高叶片的相对含水量与叶绿素含量。有研究表明，BRs可以提高小麦叶片的叶绿素含量和光合速率，从而提高小麦苗干重[22]。叶绿素是光合作用的光敏催化剂，在一定程度上可以反映植物利用光能的程度，其含量的增加可以增强植物的光合作用，促进植物生长和物质积累。本研究显示，0.001～0.005 mg·L-1LA浸种处理下小麦叶片的叶绿素含量、根长、苗鲜重和干重显著增加。结合巩文秀等[21]的结果表明，LA及其糖的衍生物浸种都能够改善小麦幼苗生长状况。

SOD、POD和CAT是植物体中普遍存在的重要的抗氧化酶，三者共同维系自由基生成与消除的动态平衡；可溶性糖、可溶性蛋白和脯氨酸等渗透调节物质是植物体内重要的保护物质，在某种程度上，其含量的高低与植物的抗逆性呈正相关[21]。研究表明，0.2 mg L-1的BRs处理可以通过提高干旱胁迫下刺槐叶片中的含水量、渗透调节物质以及SOD、POD和CAT等抗氧化酶的活性来增强植物的抗逆能力[23]；在低温胁迫下喷施0.1 μmol·L-1BRs，辣椒幼苗根系的抗氧化酶活性显著提高[24]。Aghdam等[25]报道，低温胁迫下喷施BRs可以增加西红柿中多酚、脯氨酸的含量，降低MDA的含量以维持细胞膜的完整性，从而提高了其耐寒性。巩文秀等[26]报道，喷施LA糖的衍生物可通过提高抗氧化酶活性和渗透调节物质来增强黄瓜幼苗的抗旱能力。本研究表明，0.001～0.005 mg·L-1LA浸种可以维持小麦幼苗中SOD、POD和CAT较高的活性，减缓MDA的积累，减轻自由基引发的过氧化作用，保持细胞膜结构和功能的相对稳定，从而增强植物的代谢活力。此外，0.001～0.005 mg·L-1LA浸种还可以提高小麦幼苗中脯氨酸、可溶性糖等渗透调节物质的积累量，提高了植物的渗透调节能力。总的来看，小麦种子的发芽率、发芽势和发芽指数、小麦幼苗的株高、苗鲜重和苗干重、小麦叶片中SOD、POD和CAT活性以0.001 mg·L-1LA处理最高。0.005 mg·L-1LA浸种处理小麦幼苗的根长和真叶长、可溶性糖、可溶性蛋白以及游离脯氨酸的含量最佳。小麦苗期常受天气影响形成苗期干旱胁迫。LA浸种可提高小麦抗氧化酶活性和渗透调节物质的含量，这种防御机制有利于小麦安全度过干旱时期，其大田调控效果还有待进一步验证。

参考文献：

[1] LIU J N,ZHANG D,SUN X Y,etal.Structure-activity relationship of brassinosteroids and their agricultural practical usages [J].Steroids,2017,124:15.

[2] SASSE J M.Physiological actions of brassinosteroids:An update [J].JouralofPlantGrowthRegulation,2003,22(4):276.

[3] SUSILA T,REDDY S A,RAJKUMAR M,etal.Effects of sowing date and spraying of brassinosteroid on yield and fruit quality characters of watermelon [J].WorldJournalofAgriculturalSciences,2012,8(3):223.

[4] JANECZKO A,OKLEETKOVA J,POCIECHA E,etal.Physiological effects and transport of 24-epibrassinolide in heat-stressed barley [J].ActaPhysiologiaePlantarum,2011,33(4):1249.

[5] RAMAKRISHNA B,RAO S S R.Preliminary studies on the involvement of glutathione metabolism and redox status against zinc toxicity in radish seedlings by 28-Homobrassinolide [J].EnvironmentalandExperimentalBotany,2013,96:52.

[6] ZHOU Y,XIA X,YU G,etal.Brassinosteroids play a critical role in the regulation of pesticide metabolism in crop plants [J].ScientificReports,2015,5.

[7] ISMAILI J,BOISVERT M,LONGPRE,etal.Brassinosteroids and analogs as neuroprotectors:Synthesis and structure-activity relationships [J].Steroids,2012,77(1):91.

[8] STEIGEROVA J,RAROVA L,OKLESTKOVA J,etal.Mechanisms of natural brassinosteroid-induced apoptosis of prostate cancer cells [J].FoodandChemicalToxicology,2012,50(11):4068.

[9] BAJGUZ A.An enhancing effect of exogenous brassinolide on the growth and antioxidant activity in chlorella vulgaris cultures under heavy metals stress [J].EnvironmentalandExperimentalBotany,2010,68(8):175.

[10] 张存莉,王冬梅,朱 玮,等.黑刺菝葜茎的化学成分研究 [J].中国药学杂志,2006,41(20):1540.

ZHANG C L,WANG D M,ZHU W,etal.Study on chemical constituents from stem ofSmilaxscobinicaulis[J].ChinesePharmaceuticalJournal,2006,41(20):1540.

[11] 郭 杰,管 桦,张存莉,等.拉肖皂苷元和拉肖皂苷C对油菜种子萌发和幼苗生长的影响 [J].北方园艺,2010(24):12.

GUO J,GUAN H,ZHANG C L,etal.Effects of laxogenin and smilscobinoside C on seed germination and seedlings growth of rape [J].NorthernHorticulture,2010(24):12.

[12] 王维彦,张存莉.拉肖皂苷元和拉肖皂苷C对玉米种子萌发及幼苗生长的影响 [J].种子.2011,30(12):15.

WANG W Y,ZHANG C L.Effects of laxogenin and smilscobinoside C on seed germination and seedlings growth of maize [J].Seed,2011,30(12):15.

[13] WANG Q,XU J,LIU X L,etal.Synthesis of brassinosteroids analogues from laxogenin and their plant growth promotion [J].NaturalProductResearch,2015,29(2):149.

[14] IGIESIAS-ARTEAGA M A,SMUTA-LOPEZ E M,XOCHIHUA-MORENO S,etal.A convenient procedure for the synthesis of 3beta-hydroxy-6-oxo-5alpha-steroids:Aplication to the synthesis of laxogenin [J].JournaloftheBrazilianChemicalSociety,2005,16(3A):381.

[15] FASCIOlA A A.Phytosterol spirostane and spirostene derivatives having a wide variety of utilities in humans and other animals:U.S.Patent Application 13/999,672[P].2014-3-17.

[16] 孙 群,胡景江.植物生理学研究技术 [M].杨凌：西北农林科技大学出版社,2005:165-170.

SUN Q,HU J J.Research Techniques of Plant Physiology [M].Yangling:Northwest A&F University Press,2005:165-170.

[17] 高俊峰.植物生理学实验指导 [M].北京:高等教育出版社,2006:210-211.

GAO J F.Experiments guidance of plant physiology [M].Beijing:Higher Education Press,2006:210-211.

[18] 李合生.植物生理生化试验原理和技术 [M].北京:高等教育出版社,2000:119-120.

LI H S.Plant physiology and biochemistry experimental principles and techniques [M].Beijng:Higher Education Press,2000:119-120.

[19] ANURADHA S,RAO S S R.Effect of brassinosteroids on salinity stress induced inhibition of seed germination and seedling growth of rice(OryzasativaL.) [J].PlantGrowthRegulation,2001,33(4):151.

[20] STEBER C M,MCCOURT P.A role for brassinosteroids in germination inArabidopsis[J].PlantandCellPhysiology,2001,125(2):763.

[21] 巩文秀,郭 杰,张存莉.等.拉肖皂苷C对小麦种子萌发及幼苗生长的影响 [J].麦类作物学报,2014,34(9):1281.

GONG W X,GUO J,ZHANG C L.Effect of laxogenin-C on seed germination and growth of wheat seedlings [J].JournalofTriticeaeCrops,2014,34(9):1281.

[22]SAIRAM R K.Effects of homobrassinolide application on plant metabolism and grain yield under irrigated and moisture-stress conditions of two wheat varieties [J].PlantGrowthRegulation,1994,14(2):173.

[23] LI K R,WANG H H,HAN G,etal.Effects of brassinolide on the survival,growth and drought resistance ofRobiniapseudoacaciaseedlings under water-stress [J].NewForests,35(3):255.

[24] 李 杰,杨 萍,颉建明,等.2,4-表油菜素内酯对低温胁迫下辣椒幼苗根系生长及抗氧化酶系统的影响 [J].核农学报,2015,29(5):1001.

LI J,YANG P,JIE J M,etal.Effects of 2,4-epibrassinolide on growth and antioxidant enzymes system in pepper roots under chilling stress [J].JournalofNuclearAgriculturalSciences,2015,29(5):1001.

[25] AGHDAM M S,ASGHARI M,FARMANI B,etal.Impact of postharvest brassinosteroids treatment on PAL activity in tomato fruit in response to chilling stress [J].ScientiaHorticulturae,2012,144:116.

[26] 巩文秀,马力,张存莉.喷施拉肖皂苷C提高黄瓜幼苗对抗干旱胁迫的生理效应 [J].植物营养与肥料学报,2016,22(2):565.

GOU W S,MA L,ZHANG C L.Physiological effects of laxogenin C on increasing the resistance to drought stress of cucumber seedlings [J].JournalofPlantNutritionandFertilizer,2016,22(2):565.