张清峰， 陈继光， 郑国栋

(江西农业大学食品科学与工程学院/江西省天然产物与功能食品重点实验室，江西南昌 330045)

土茯苓是百合科菝葜属植物光叶菝葜的干燥根茎，为《中华人民共和国药典》收载的中药材，也是民间常用的食材，是制作传统食品龟苓膏的主要原料，也常用于煲汤。《中华人民共和国药典》记载土茯苓具有除湿、解毒、通利关节的功效[1]。现代药理研究显示，土茯苓提取物有抗氧化[2]、降血糖[3]、抑制肝癌细胞增殖和诱导其调亡的作用[4]，并有独特的抗慢性炎症和选择性免疫抑制作用[5-6]。化学成分研究表明，落新妇苷、黄杞苷等黄酮成分是土茯苓的主要功效物质[7]。2010版《中华人民共和国药典》以落新妇苷含量评价土茯苓质量，要求含量不低于 0.45%[1]，另外土茯苓也含有白藜芦醇、丁香酸、莽草酸、5-O-咖啡酰莽草酸等芪类及酚酸类物质[8-9]。

百合科菝葜属植物在我国广泛分布，据报道有79种之多[10]。《中华人民共和国药典》收录菝葜和土茯苓2种中药，但还有许多都作为地方药材使用。各地使用土茯苓的历史沿革不一致，导致市场上出现长期以其他菝葜属和肖菝葜属的植物作代用品的现象，如菝葜属的菝葜、肖菝葜属的华肖菝葜和短柱肖菝葜等。目前市场流通的土茯苓多为经加工制得的饮片，难以从商品药材性状作真伪鉴别，因此各地区使用的土茯苓药材质量参差不齐，严重影响了土茯苓及其制剂的疗效。笔者前期研究发现，不同品牌龟苓膏样品中来源于土茯苓的黄酮成分落新妇苷含量差异巨大，有些甚至检测不到[11]。其中一个原因可能是市场上流通的土茯苓质量良莠不齐，且伪品众多，龟苓膏生产厂家可能因缺乏相应技术而误用了土茯苓伪品或次品。因此，笔者建立了土茯苓的HPLC指纹图谱，可以方便鉴别土茯苓及其混淆品[12]。本研究收集了市场上流通的54份土茯苓样品，利用HPLC指纹图谱方法对其进行真伪及质量调查研究。

1 材料与方法

1.1 试剂与原料

色谱纯乙腈(沃凯)购自国药集团化学试剂有限公司。落新妇苷标品(≥98%)购自上海同田生物有限公司。54份土茯苓样品，其中20份购自网络(表1样品序号1～20)，34份购自江西省南昌市及樟树市实体药店。其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器设备

HPLC为安捷伦1260系统，配自动进样器和二极管阵列检测器。色谱柱为Waters Symmatry C18柱(250 mm×4.6 mm i.d.，5 μm)。

1.3 色谱条件

流动相为乙腈(A)和0.1%醋酸-水(B)；流速为 1 mL/min；进样量10 μL；检测波长291 nm；柱温40 ℃；线性梯度洗脱程序为0～15 min，16.0%～21.0%(A)；15～40 min，21.0%～40.0%(A)。

1.4 土茯苓供试样品溶液的制备

土茯苓样品经粉碎后过40目筛，精密称取粉末0.5 g，置于具塞锥形瓶中，加入25 mL 60%乙醇，密塞后称质量，超声提取30 min，再称质量，用60%乙醇补足减失的质量。上清液经0.45 μm滤膜过滤，作为供试品溶液进行HPLC分析。

2 结果与分析

2.1 土茯苓指纹图谱及鉴定标准

本研究前期建立了土茯苓的HPLC标准指纹图谱，如图1所示[12]。土茯苓HPLC指纹图谱中主要有9个色谱峰，通过质谱联用峰1、峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8、峰9分别鉴定5-O咖啡酰莽草酸、新落新妇苷、落新妇苷、花旗松素、新异落新妇苷、异落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷、白黎芦醇[12]，各化合物化学结构如图2所示。峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7为所有土茯苓样品的共有色谱峰，而峰4、峰8、峰9在一些样品中因含量过低，可能检测不到[13]。因此，在土茯苓样品真伪鉴定过程中，样品色谱图与土茯苓标准指纹图谱一致或同时含有峰1、峰2、峰3、峰5、峰6、峰7的判定为土茯苓，否则判定为伪品。通过DAD检测器，可同时获得各峰的紫外吸收图谱用于与指纹图谱对照，峰2、峰3、峰4、峰5、峰6、峰7、峰8的紫外吸收图类似，都在290 nm有最大吸收，因为它们都是二氢黄酮类物质；峰1的最大吸收波长为 327 nm，峰9的最大吸收波长为330 nm(图3)。

2.2 土茯苓落新妇苷含量测定

《中华人民共和国药典》2010版以落新妇苷含量评估土茯苓质量，要求含量不低于0.45%。将不同浓度的落新妇苷标准溶液按“1.3”节色谱条件进行分析，以落新妇苷的峰面积(y)与相对应的浓度(x)进行线性回归分析，得定量回归方程：y=18.6x-0.2；r2=0.993，用于土茯苓样品中落新妇苷含量测定。

2.3 市售土茯苓真伪及质量判定结果

将54批市售土茯苓制得的样品溶液按“1.3”节的色谱条件进行HPLC分析，获得的液相色谱图按“2.1”节进行真伪判定。表1结果表明，54份样品中有13个样品经指纹图谱分析为伪品，占24.1%。其中网购样品中有5个，占网购样品的25%；实体药店购买的有8个，占实体店所购样品的23.5%。由此可知，市售土茯苓中约1/4为伪品，且网店与实体药店所售土茯苓伪品比例相当。部分土茯苓伪品的液相色谱图见图4。将这些伪品粉碎后混入饲料给小鼠喂食，部分伪品会引起小鼠中毒死亡。

将色谱图中峰3的峰面积按“2.2”节中落新妇苷的定量标准线换算，获得土茯苓中落新妇苷含量。2010版《中华人民共和国药典》规定土茯苓饮片中落新妇苷的含量不能低于0.45%[1]。对54批土茯苓样品测定结果表明，落新妇苷含量参差不齐，差异巨大，含量范围为0.042%～3.063%。只有24个土茯苓样品符合《中华人民共和国药典》落新妇苷含量规定，合格率仅为44.4%。其中通过网络购买的有9个，占所有网购样品的45%；实体药店购买的有15个，占实体药店样品的44.1%，网店与实体药店所售土茯苓质量无差异。

根据土茯苓真伪及质量判定结果，市售土茯苓样品中，接近1/4为伪品，超过半数质量不符合2010版《中华人民共和国药典》规定的标准。土茯苓是常用的中药及食品原料，中药讲究配伍，质量不符合要求的土茯苓会影响疗效，而伪品甚至会带来中毒的风险。笔者前期对龟苓膏样品的分析结果表明，一些标签中注明使用了土茯苓原料的龟苓膏样品中检测不到落新妇苷，不同品牌龟苓膏样品中落新妇苷含量差异巨大[12]。市售土茯苓伪品众多、质量良莠不齐可能是造成这一现象的原因。而笔者建立的土茯苓指纹图谱可以很好地帮助厂家解决土茯苓原料质量问题。

表1 54批土茯苓样品真伪及质量判定结果

3 结论

通过土茯苓HPLC标准指纹图谱对54批市售土茯苓样品进行真伪鉴定和质量判定，结果表明土茯苓伪品比例为24.1%，符合《中华人民共和国药典》质量要求的土茯苓仅为样品总数的44.4%。部分土茯苓伪品喂食小鼠后甚至有中毒死亡现象。土茯苓是常用的中药及食品原料。市售土茯苓伪品众多、质量良莠不齐是一个亟待解决的问题。土茯苓指纹图谱方法简便、准确，可为土茯苓的真伪鉴别及质量控制提供参考依据。

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