位路路，林 杨，王月华，孟宪军*

（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳 110866）

黑果腺肋花楸（Aronia melanocarpa）是一种多酚类物质含量极高的独特浆果，也是水果和浆果中清除自由基的佼佼者[1]。Zheng Wei等[2]通过氧自由基吸收能力测定法测得黑果腺肋花楸比蓝莓、越橘和蔓越莓的抗氧化活性高出几倍；文献[3-4]通过对黑果腺肋花楸与9 种黑莓、3 种树莓、9 种黑加仑、4 种红加仑等浆果进行比较发现，黑果腺肋花楸中总酚的含量是其他浆果的数倍，而花青素含量也明显高于以上几种浆果。黑果腺肋花楸多酚主要为花色苷、黄酮和酚酸，其中花色苷约占总酚含量的25%[5]。

花色苷等活性物质生物利用度比较低，但是有足够的证据已经证明黑果腺肋花楸花色苷具有抗氧化、减少血浆胆固醇、改善血糖[6]、抗炎、抗尿道感染、心脏保护、肝保护[7]、抗诱变[5]和抗癌[8]等功能[9-10]，所以采用有效的方式提取纯化花色苷是非常必要的[11]。Jakobekd[12]及Wangensteen[13]等已对不同产地不同品种的黑果腺肋花楸提取物成分做了鉴定，在此基础上对于刚引进中国栽培的黑果腺肋花楸花色苷提取物的成分探究也是必不可少的。本实验在料液比、提取温度、乙醇体积分数、超声时间、超声功率和pH值单因素试验基础上，采用响应面法优化黑果腺肋花楸花色苷提取条件，所得提取物经过XAD-7大孔树脂纯化后冷冻干燥制成粉末，通过对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、2,2’-联氮-双-（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二铵盐自由基（2,2’-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate) radical，ABTS+·）清除能力及Fe3+还原能力（ferric reducing-antioxidant power，FRAP）方法评价黑果腺肋花楸花色苷粗提物的抗氧化性能，并且采用高效液相色谱-质谱联用法对花色苷组成进行定性分析和鉴定。

目前国外的研究主要集中在黑果腺肋花楸中的花色苷对疾病的预防和干扰功能等领域，而国内的研究还不多见，本实验旨在为提高黑果腺肋花楸花色苷提取物的含量及抗氧化性评价方面提供理论支持，并且对该果以后的推广及功能性研究提供一定的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黑果腺肋花楸鲜果购于辽宁省鞍山市，品种为“富康源1号”，放于实验室-80 ℃冰箱中冷冻保存备用。ABTS+·试剂盒、FRAP试剂盒 碧云天生物技术有限公司；DPPH 美国Sigma公司；盐酸、氯化钾、无水乙酸钠、无水碳酸钠、VC、福林-酚试剂、没食子酸标准品国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇 天津市富宇精细化工有限公司。

1.2 仪器与设备

旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；BT-100B数显恒流泵 上海沪西分析仪器厂有限公司；美的搅拌机、电子分析天平、PHS-3C型pH计 北京赛多利斯科学仪器有限公司；真空泵 巩义市予华仪器有限责任公司；UV-5800型紫外-可见分光光度仪 上海元析仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；真空冷冻浓缩系统 美国Labconco公司；高效液相色谱仪、质谱仪 美国Agilent公司；酶标仪美国博腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黑果腺肋花楸花色苷的超声波辅助提取

挑选品质良好的黑果腺肋花楸冻果，并放置常温解冻后匀浆，准确称取5.00 g黑果腺肋花楸匀浆液，按一定比例加入酸性乙醇溶液，密封后放入超声波清洗机中提取花色苷。抽滤后，40 ℃旋转蒸发除去乙醇，将提取液避光保存备用。

1.3.2 花色苷含量的测定

参照Szymanows等[14]的方法，根据pH值示差法测定花色苷含量。将0.025 mol/L氯化钾和0.4 mol/L乙酸钠用盐酸分别调制成pH 1.0和pH 4.5的缓冲液。在24 mL的缓冲液中加入1 mL样品，振荡摇匀，室温条件下避光平衡15 min，并以蒸馏水作为空白对照，在510 nm和700 nm波长下测定其吸光度，按公式（1）、（2）计算花色苷含量：

式中：A510nm为pH 1.0缓冲液于510 nm波长处的吸光度；A700nm为pH 1.0缓冲液于700 nm波长处的吸光度；A’510nm为pH 4.5缓冲液于510 nm波长处的吸光度；A’700nmpH 4.5缓冲液于700 nm波长处的吸光度；Mr为矢车菊-3-葡萄糖苷的相对分子质量（449.2）；df为样品的稀释倍数；V为提取液总体积/mL；m为黑果腺肋花楸冻果的质量/g；ε为矢车菊3-葡萄糖苷的消光系数（26 900）。

1.3.3 单因素试验

按照1.3.2节所述超声波辅助提取黑果腺肋花楸花色苷，选取提取温度、超声功率、料液比、超声时间、乙醇体积分数和pH值6个因素，改变单一因素考察对花色苷提取量的影响，单因素试验因素与水平如表1所示，每个单因素试验平行重复3 次，结果取平均值[15]。

表1 单因素试验因素与水平Table1 Coded levels of independent variables used in one-factor-at-a-time design

1.3.4 响应面试验

综合单因素试验的结果，选择超声时间（X1）、乙醇体积分数（X2）、pH值（X3）3 个因素进行响应面优化试验，根据Box-Behnken试验设计原理，以花色苷含量（Y）为响应值，利用Design-Expert 8.0进行3因素3水平响应面优化试验设计，确定黑果腺肋花楸中花色苷的最佳提取条件，试验因素与水平见表2。

表2 响应面试验设计因素与水平Table2 Coded levels of independent variables used in response surface design

1.3.5 花色苷的富集

参考相关文献[16-18]的方法并稍作修改，采取下列步骤进行花色苷的富集：先将XAD-7型大孔树脂用乙醇浸泡24 h，再用酸碱处理进行活化，采用湿法装柱，装入的树脂为柱体积的2/3。吸附：以2 mL/min的流速将1 000 mL蒸馏水泵入柱内，之后以相同流速泵入500 mL的花色苷粗提液，然后静置吸附10～12 h；除杂：用1 500 mL的蒸馏水以5.3 mL/min的流速冲掉花色苷中的糖、蛋白质和有机酸等杂质；洗脱：先用70%乙醇溶液以相同的流速对花色苷进行第1次洗脱，之后用95%的乙醇溶液进行第2次洗脱，收集2 次洗脱液。得到的液体蒸发掉乙醇后进行真空冷冻干燥，最终得到花色苷冻干粉，装于2 mL试管中密封保存，置于-80 ℃冰箱中贮藏备用。

1.3.6 多酚含量的测定

采用福林-酚法[19-20]，将1.3.5节中的黑果腺肋花楸花色苷提取物粉末配制成0.05 mg/mL样品溶液，取样品0.5 mL，加入3 mL福林-酚试剂后避光反应5 min，之后加入2.4 mL 7.5%的Na2CO3溶液，涡旋混匀，室温避光放置2 h后，测定765 nm波长处的吸光度。以没食子酸为标准样品（0～100 μg/mL），所得标准曲线方程为y=0.036 2+7.076 87x（R2=0.999 2）。多酚含量按式（3）计算，结果以没食子酸计：

式中：Y为样品中多酚含量/（mg/g）；ρ为由标准曲线方程计算所得的样品稀释液多酚质量浓度/（mg/mL）；V为样品总体积/mL；n为稀释倍数；m为样品质量/g。

1.3.7 抗氧化活性的测定

1.3.7.1 DPPH自由基清除能力

参考安小琦等[18]的方法配制DPPH工作液。根据1.3.5节所述方法得到的冻干粉和VC配成20、40、60、80、100 μg/mL质量浓度的样品溶液。配制反应液：空白组A0：150 μL 80%乙醇溶液+150 μL DPPH溶液；样品组Ai：150 μL样品溶液+150 μL DPPH溶液；对照组Aj：150 μL样品溶液+150 μL 80%乙醇溶液。配制完成后在室温条件下避光反应30～40 min后，用酶标仪在517 nm波长处测定各组反应液的吸光度，按式（4）计算DPPH自由基清除率：

1.3.7.2 ABTS+·清除能力

参照Złotek等[21]的方法略有修改。根据1.3.5节所述方法得到的冻干粉和VC配成20、40、60、80、100 μg/mL质量浓度的样品溶液。配制反应液：空白对照组：200 μL ABTS工作液+10 μL蒸馏水；标准曲线组：200 μL ABTS工作液+10 μL各浓度Trolox标准溶液；样品检测组：200 μL ABTS工作液+10 μL各浓度样品。振荡混匀，室温下反应6 min后测定734 nm波长处吸光度，最后根据标准曲线换算为Trolox当量表示样品的ABTS+·清除能力。

1.3.7.3 FRAP

参照Feng Chengyong等[22]的方法略有修改。根据1.3.5节所述方法得到的冻干粉和VC配成20、40、60、80、100 μg/mL质量浓度的样品溶液。配制反应液：空白对照组：180 μL FRAP工作液+5 μL蒸馏水；标准曲线组：180 μL FRAP工作液+5 μL各质量浓度FeSO4标准溶液；样品检测组：180 μL FRAP工作液+5 μL各浓度样品。振荡混匀，在38 ℃反应5 min后测定593 nm波长处吸光度，最后根据标准曲线换算为Trolox当量来表示样品的FRAP值。

1.3.8 花色苷组成的鉴定

样品前处理：准确称取0.01 mg样品，溶于1 mL含有0.01%盐酸的色谱级甲醇中，经0.45 µm膜过滤，-80 ℃备用分析。

高效液相色谱测定条件：分离柱：Diamonsil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱温：20 ℃；进样量：20 μL；检测波长：520 nm和350 nm；流动相A：0.1%甲酸溶液；流动相B：乙腈；梯度洗脱程序：0～40 min，0%～40% B；40～45 min，40%～45% B；45～52 min，45%～0% B。流速：0.7 mL/min。

质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描模式，扫描范围m/z 10～1 000；雾化气压力30 psi；干燥器流速12 L/min；阈值500；干燥器温度350 ℃，毛细管电压3 500 V[18]。

1.4 数据统计

所有实验重复3 次，结果采用 ±s表示，实验数据采用SPSS 19.0软件分析显著性（P＜0.05），采用Origin 7.5软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

图1 提取温度对花色苷含量的影响Fig.1 Effect of extraction temperature on anthocyanins extraction

2.1.1 提取温度对黑果腺肋花楸花色苷提取的影响

如图1所示，随着提取温度的升高，黑果腺肋花楸花色苷含量呈先升高后降低的趋势。当温度达到60 ℃时花色苷含量最高（P＜0.05）。温度的升高使细胞内花色苷更易溶出，提取率升高。但当温度过高，促使花色苷降解，含量下降[23]。

2.1.2 超声功率对黑果腺肋花楸花色苷提取的影响

图2 超声功率对花色苷含量的影响Fig.2 Effect of ultrasonic power on anthocyanins extraction

如图2所示，随着超声功率的提高，花色苷含量并没有明显的提高。试验选取80～200 W的功率范围内，花色苷含量没有明显的趋势性（P＞0.05），花色苷含量在超声功率为100 W时比其他略高，因此在后续的响应面优化试验中，超声功率选为100 W。

图3 料液比对花色苷含量的影响Fig.3 Effect of solid/liquid ratio on anthocyanins extraction

2.1.3 料液比对黑果腺肋花楸花色苷提取的影响

如图3所示，随着溶剂用量的逐渐提高，黑果腺肋花楸花色苷含量也逐渐上升。当料液比在1∶30（g/mL）时，含量明显提高（P＜0.05），但当继续增加提取试剂用量后，随着乙醇溶液用量的增加，含量略有降低。说明当料液比为1∶30（g/mL）时，黑果腺肋花楸中的花色苷物质大部分已溶出。随着料液比的变化，果渣中糖类与脂类物质的溶出影响了多酚类物质的提取。

2.1.4 超声时间对黑果腺肋花楸花色苷提取的影响

图4 超声时间对花色苷含量的影响Fig.4 Effect of ultrasound time on anthocyanins extraction

如图4所示，随着超声时间的延长，花色苷含量逐渐增加，并在30 min时出现最大值（P＜0.05）。而后，随着超声时间的延长，花色苷含量逐渐减小。这说明在30 min时，花色苷含量已经被充分提取。随着处理时间的延长，使得其中一部分花色苷被氧化、分解，导致提取量逐渐下降。

2.1.5 乙醇体积分数对黑果腺肋花楸花色苷提取的影响

图5 乙醇体积分数对花色苷含量的影响Fig.5 Effects of ethanol concentration on anthocyanins extraction

如图5所示，随着乙醇体积分数的不断增加，黑果腺肋花楸提取物中的花色苷含量逐渐上升，原因是高浓度乙醇拥有着高渗透力，有利于花色苷的溶出，但过高的乙醇浓度致使溶液极性过低，与弱极性花色苷不相溶[24]，所以选择体积分数60%的乙醇溶液（P＜0.05）。

2.1.6 pH值对黑果腺肋花楸花色苷提取的影响

图6 pH值对花色苷含量的影响Fig.6 Effects of pH on anthocyanins extraction

如图6所示，随着pH值的升高花色苷含量也随之升高，并在pH 2.0时出现最大值（P＜0.05），而后随着pH值的升高花色苷含量略有下降，原因可能是过低的pH值会使糖基水解，使花色苷的稳定性下降，pH值高于2后花色苷不稳定显色变浅[25]。

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面试验设计及结果分析

综合单因素试验结果，选择超声时间（X1）、乙醇体积分数（X2）、pH值（X3）3 个因素，以花色苷含量（Y）为响应值，利用Design-Expert软件设计3因素3水平的响应面试验[25]，试验结果如表3所示。

表3 响应面试验设计与结果Table3 Experimental design and results for response surface analysis

对表3试验数据进行回归拟合，得到花色苷含量（Y）的二次多项回归模型为Y=3.29+0.035X1+9.341×10-3X2+0.02X3+0.029X1X2-0.014X1X3+0.037X2X3-0.068-0.19-0.20。

表4 黑果腺肋花楸花色苷含量的方差分析Table4 Analysis of variance for the effect of variables on anthocyanins content

由表4可知，该回归模型P值小于0.000 1，模型极显著，失拟项不显著。R2值为0.998 1，值为0.995 6，说明回归方程拟合程度高，可用于黑果腺肋花楸花色苷含量的分析。该模型Y中各项对结果影响都显著，X1、、和是极显著项，其他为显著项。

由图7可看出，超声时间、乙醇体积分数和pH值交互作用对黑果腺肋花楸花色苷含量的影响。根据响应面图的特点[23]，其曲线走势相对越陡，说明该因素对黑果腺肋花楸花色苷含量的影响越显著。超声时间对花色苷含量影响最显著，pH值对花色苷含量影响较为显著，而乙醇体积分数对花色苷含量的影响最弱。通过响应面图和表4可知，影响花色苷提取的因素主次顺序为：超声时间＞pH值＞乙醇体积分数。

图7 各因素交互作用的响应面图Fig.7 Response surface plots showing the interactive effects of factors on anthocyanins content

2.2.2 最佳条件的确定及验证实验

通过Design-Expert 8.0软件分析得到最佳黑果腺肋花楸花色苷提取工艺条件为乙醇体积分数64.33%、提取时间31.08 min、pH 2.03，但考虑到实际操作的可行性，将以上工艺条件调整为乙醇体积分数64%、提取时间31 min、pH 2.0。根据此条件进行3 组平行实验，得黑果腺肋花楸中的花色苷含量平均值为（3.61±0.01）mg/g，该实际值与理论值接近且稳定，说明采用响应面优化法得到的最佳工艺条件可靠[24]。

2.3 抗氧化活性测定结果

2.3.1 DPPH自由基清除能力

图8 花色苷和VC对DPPH自由基的清除率Fig.8 DPPH free radical scavenging effect of anthocyanins and VC

由图8可知，花色苷与VC对DPPH自由基的清除能力随质量浓度的增加而增大，且花色苷的抗氧化性比VC强，在质量浓度为100 µg/mL时DPPH自由基清除率达到99.09%。虽然不像ABTS+·清除能力和FRAP具有显著差异性，但规律保持一致。

2.3.2 ABTS+·清除能力

图9 花色苷和VC对ABTS＋·的清除能力Fig.9 ABTS+· scavenging activity of anthocyanins and VC

由图9可以得出，花色苷与VC对ABTS+·清除能力随质量浓度的升高而增大，且花色苷的抗氧化性显著高于VC（P＜0.05），在100 µg/mL时花色苷清除ABTS+·的能力相当于2.5 倍的Trolox和2 倍的VC。

2.3.3 FRAP

图10 花色苷与VC的FRAP值的测定Fig.10 Determinatim of FRAP value of anthocyanins and VC

由图10可以得出，花色苷与VC的FRAP随质量浓度的升高而增大，且花色苷的抗氧化性显著高于VC（P＜0.05），在100 µg/mL时花色苷FRAP相当于2.5 倍的Trolox和4 倍的VC。

2.4 黑果腺肋花楸提取物花色苷组成成分的分析

图11为黑果腺肋花楸花色苷提取物色谱图，共有5 个峰，图12～14分别为峰1、峰2和在液相色谱图中未检测到峰的矢车菊-3,5-二己糖苷的质谱图。

图11 黑果腺肋花楸提取物中花色苷高效液相色谱图Fig.11 HPLC prof i les of anthocyanins from A. melanocarpa extracts

表5 黑果腺肋花楸提取物中花色苷组成鉴定Table5 Identif i cation of anthocyanins in A. melanocarpa extracts

根据图11～14和表5可知，黑果腺肋花楸提取物中含有6 种花色苷，并且都为矢车菊类（m/z 287）花色苷。由图12可知，峰1物质分子离子m/z 897，其碎片离子m/z 735和m/z 573是由母离子连续失去一分子己糖得到[M-162]+，m/z 287为矢车菊素的配离子峰，通过查阅文献[18]分析可知峰1物质为矢车菊-己糖苷二聚体，为首次检测出的一种花色苷。由图13可知，峰2物质分子离子m/z 449，其碎片离子m/z 287是由母离子失去一分子己糖得到[M-162]+，根据保留时间和文献[26-28]分析峰2物质为矢车菊-3-半乳糖苷，峰面积百分比最大，约为55.29%。同理，峰3～5物质为矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3-阿拉伯糖苷和矢车菊-3-木糖苷。图14中物质分子离子m/z 611，其碎片离子m/z 449和m/z 287是由母离子连续失去一分子己糖得到[M-162]+，参考文献[18]可得该物质为矢车菊-3,5-二己糖苷，在液相色谱图中并没有找到对应的峰，但在质谱条件下被检测到，猜测可能是由于矢车菊-3,5-二己糖苷在黑果腺肋花楸中含量极少，在一般液相色谱-质谱联用检测中没有出峰。由于生长环境与品种的不同，与Wangensteen等[13]研究结果中黑果腺肋花楸提取物4 种花色苷组成比例略有差异，组成成分增加了2 种含量极少的花色苷。

图12 矢车菊-3-己糖苷二聚体的一级（A）、二级（B）质谱图（峰1）Fig.12 Mass (A) and tandem mass (B) spectra of dimer of cyanidinhexoside (peak 1)

图13 矢车菊-3-半乳糖苷的一级（A）、二级（B）质谱图（峰2）Fig.13 Mass (A) and tandem mass (B) spectra of cyanidin-3-galactoside (peak 2)

图14 矢车菊-3,5-二己糖苷的一级（A）、二级（B）质谱图Fig.14 Mass (A) and tandem mass (B) spectra of cyanidin-3,5-dihexoside

3 结 论

通过对影响黑果腺肋花楸花色苷提取效果的提取温度、超声功率、料液比、超声时间、乙醇体积分数、pH值进行单因素和响应面试验，确定黑果腺肋花楸花色苷的最佳提取工艺参数为乙醇体积分数64%、pH 2.0、料液比1∶30（g/mL）、超声温度60 ℃，超声功率100 W、超声时间31 min，在该条件下黑果腺肋花楸中的花色苷含量可达（3.61±0.01）mg/g，相比Slimestad[29]和Wangensteen[13]等分别采用的80%甲醇溶液的溶剂提取法和80%乙醇溶液的回流提取法提取的花色苷，含量都有所提高。得到的提取物进一步经过XAD-7树脂纯化后，冻干粉中多酚含量为655.107 mg/g，花色苷含量为195 mg/g，占多酚含量的30.53%，起着主要的抗氧化作用。通过实验表明，黑果腺肋花楸花色苷提取物有清除DPPH自由基、ABTS+·能力和FRAP活性，均显著高于VC，在花色苷质量浓度为100 µg/mL时DPPH自由基清除率达到99.09%，清除ABTS+·能力和FRAP值分别相当于2 倍和4 倍的VC，与蓝靛果清除DPPH自由基[30-31]和ABTS+·[18]能力相比，黑果腺肋花楸花色苷提取物的抗氧化能力较强。通过高效液相色谱-串联质谱技术鉴定出6 种花色苷，矢车菊-3-半乳糖苷含量最高，其次为矢车菊-3-阿拉伯糖苷。其他2 种新鉴定出来的花色苷可能为矢车菊-己糖苷二聚体和矢车菊-3,5-二己糖苷。矢车菊-3,5-二己糖苷并未在色谱图中找到对应的峰，可能是含量比较低，在样品浓度较大或使用非常灵敏的仪器时才能检测出来。综上所述，黑果腺肋花楸花色苷种类比较单一，都属矢车菊家族花色苷，更有利于分离出单体，而且抗氧化性是VC的2～4 倍。

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