王晓军，吴 婷，贾 伟，张春晖，韩 玲*，余群力

（1.甘肃农业大学食品科学与工程学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100193）

胶原蛋白是一种纤维状蛋白质，是生物体重要的结构蛋白，大约占体内总蛋白质含量的25%，在保健品、生物药品、化妆品及食品行业中都有着广泛的应用[1]。胶原蛋白种类很多，根据其结构差异，目前已知的超过30 种，分别被命名为I型、II型、III型[2]。I型胶原蛋白由2 条相同的α1多肽链和1 条与α1链氨基酸组成不同的α2链组成；2 条α链聚合形成β链，3 条α链构成的三螺旋结构为γ链，然后又相互缠绕成超螺旋结构[3-4]。I型胶原蛋白主要存在于动物的骨、肌腱、皮肤、韧带及许多间质结缔组织中。

目前已有不少关于提取胶原蛋白的研究报道，温慧芳等[5]采用碱法、盐法、热水法、酸法与酶法提取鮰鱼皮中的胶原蛋白，并对提取的胶原蛋白进行分析，结果表明酸法、酶法和热水法提取的胶原蛋白均为I型胶原蛋白，并保留了较好蛋白结构。刘苏锐等[6]采用酸膨胀-胃蛋白酶降解法用猪皮制备胶原蛋白，提取的I型胶原蛋白很好地保持了天然胶原的螺旋结构。何兰[7]以牛骨为原料提取胶原蛋白，结果表明牛长骨中提取的酸溶性胶原蛋白及酶溶性胶原蛋白中甘氨酸约占氨基酸总量的1/3，为典型I型胶原蛋白，且存在完整的三螺旋结构。刘静[8]以牦牛骨粉为原料制备牦牛骨胶原多肽，通过单因素试验和响应面试验对酶进行筛选并优化酶解条件得到酶解法制备的牦牛骨胶原多肽。胶原蛋白的研究很多，但牦牛骨中胶原蛋白的研究较少。我国是牦牛种群和数量最多的国家，占世界牦牛总数的92%以上[9-10]，但大量的研究都集中于不同品种地域牦牛肉的营养成分、产肉产乳性能以及相关的分子生物学方面，忽略了牛骨这一副产物的研究开发，大量的牦牛骨未被充分利用，造成资源的浪费和流失。牦牛骨内含有丰富的蛋白质、氨基酸及其他微量元素[11]，其中蛋白质质量分数占到20%～30%，且主要为胶原蛋白[12]。

本实验采用酸法和酶法分别从牦牛骨中提取胶原蛋白，并且通过对比分析这2 种方法所提取胶原蛋白的结构特征，验证了这2 种方法提取牦牛骨胶原蛋白的可行性，确定了牦牛骨胶原蛋白的类型，为牦牛骨的利用和胶原蛋白高值化产品开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

青海牦牛骨（采自自然放牧条件下，发育正常、健康无病、3～4 岁龄牦牛） 青海省海北藏族自治州畜牧兽医科学研究所。

AAS18氨基酸标准品（纯度≥99%） 美国Sigma公司；标准蛋白Marker 美国Thermo公司；丙烯酰胺、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考马斯亮蓝R-250、四甲基乙二胺（N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine，TEMED）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、胃蛋白酶（1 200 U/g）、其他试剂（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

85-2型数显恒温磁力搅拌器 江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；DGF30-IA型电热鼓风干燥箱 南京试验仪器厂；L-8900氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司；TU-1810型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限公司；TENSOR27傅里叶变换红外光谱（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）仪 瑞士Bruker公司；Q200差示扫描量热（differential scanning calorimeter，DSC）仪 美国TA公司；Quanta 200扫描电子显微镜（scanning electron microscope，SEM） 荷兰FEI公司；Mini-protein垂直电泳槽 美国Bio-Rad公司；X-12R高速冷冻离心机 美国Beckman公司；BS214D电子天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司。

1.3 方法

1.3.1 胶原蛋白提取工艺流程

牦牛骨→去除残余肉及表面杂质→脱脂→乙二胺四乙酸脱钙→0.5 mol/L乙酸溶液提取（或0.5 mol/L的乙酸溶液以及1.6%胃蛋白酶提取）→盐析→离心→乙酸复溶→透析→蒸馏水透析→真空冷冻干燥

1.3.2 酸法提取

脱脂脱钙完全后，用0.5 mol/L的冰醋酸溶液以质量比1∶10溶解，振摇浸提1～5 d，收集上清液，采用盐析的原理使溶液中的胶原蛋白沉淀析出。向上述上清液中加入Tris（6 g/L提取液），pH 7.5，调至最佳盐析浓度，搅拌均匀静置过夜后，4 ℃、10 000 r/min离心30 min，将沉淀物冻干即得酸溶性胶原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）粗品[13]。通过3 次重复实验，按下式计算胶原蛋白得率，ACS的得率为（2.24±0.3）%。

1.3.3 酶法提取

脱脂脱钙完全后，同时加入0.5 mol/L的乙酸溶液和1.6%（按牛骨原料质量计）胃蛋白酶（1 200 U/g）。牛骨与乙酸溶液质量比为1∶10，振摇浸提1～5 d。收集上清液并加入Tris（6 g/L提取液），调节pH 7.5，加热至90 ℃以上灭酶10 min，调至最佳盐析浓度，搅拌均匀静置过夜后，4 ℃、10 000 r/min离心30 min，将沉淀物冻干即得酶溶性胶原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）粗品[13]。通过3 次重复实验，按1.3.2节计算胶原蛋白得率，PSC得率为（3.32±0.4）%。

1.3.4 透析

将胶原蛋白粗品使用0.5 mol/L冰醋酸复溶，然后依次用0.1 mol/L冰醋酸溶液和蒸馏水进行透析。透析结束将沉淀物冻干即得相对较纯的胶原蛋白样品，贮存待测。

1.3.5 胶原蛋白的结构分析

1.3.5.1 氨基酸组成与含量分析

取约50 mg胶原蛋白，加入10 mL 6 mol/L HCl溶液，110 ℃水解24 h；酸水解后过滤，将滤液定容至50 mL；取1 mL氮吹至干，再向其中加入5 mL 0.02 mol/L HCl溶液复溶，振荡混匀，用0.20 μm的滤膜过滤，用氨基酸自动检测仪进行测定。

1.3.5.2 牦牛骨胶原蛋白紫外光谱分析

参考Caputo等[14]方法稍有改动，用蒸馏水溶解冻干的骨胶原蛋白样品并配制成2 mg/mL溶液，常温下用紫外-可见分光光度计在200～400 nm波长范围内扫描，波长间隔1 nm，蒸馏水为空白。

1.3.5.3 牦牛骨胶原蛋白FTIR分析

采用FTIR对牦牛骨胶原蛋白二级结构的组成进行分析，参考倪娜等[15]的方法，并稍作修改。扫描范围为4 000～400 cm-1，分辨率4 cm-1，以空气为背景，将冻干样品完全覆盖检测器进行测定，获取样品FTIR图。

1.3.5.4 热收缩温度的测定

采用DSC法测定牦牛骨胶原蛋白的热收缩温度。取约10 mg样品于铝制坩埚中，加盖后压片密封，以空铝制坩埚作为参比。25 ℃保持1 min，从25 ℃升温至100 ℃，100 ℃保持1 min，升温速率为2 ℃/min。

1.3.5.5 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDSPAGE）分析

参考Laemmil[16]的方法并稍作修改，将样品于0.5 mol/L的乙酸溶液中溶解后调至中性，按1∶1的比例与上样缓冲液混合后，沸水浴3～5 min，冷却后进行离心，取上清液10 μL上样。浓缩胶4%，分离胶12%。采用直压恒流电源，浓缩胶电压75 V，分离胶电压110 V，结束后，用考马斯亮蓝R-250染色40 min，脱色后观察分析。1.3.5.6 微观结构观察

用SEM观察牦牛骨胶原蛋白的微观结构，参考Palka等[17]的方法并稍作修改。取适量形状规则的冻干牦牛骨胶原蛋白样品，经真空离子镀膜仪喷金后进行微观结构观察。

1.4 数据统计

使用Microsoft Excel 2013软件进行数据整理，所有数据以 ±s表示，采用SPSS 20.0软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 氨基酸组成与含量分析

表1 青海牦牛骨胶原蛋白氨基酸含量Table1 Amino acid composition of two collagens

由表1可知，青海牦牛骨ASC和PSC中特征性氨基酸（Gly、Pro、Hyp）总量分别为277.9、297.5 mg/g；Gly含量最多，分别占总氨基酸的25.5%和24.6%，因为胶原蛋白多肽链的很长区段序列由Gly-X-Y氨基酸序列重复而组成，从而Gly的含量较高[18]；Hyp作为胶原蛋白的特征氨基酸，对肽链间氢键的形成起到促进作用，氢键又能维持胶原蛋白三螺旋结构的稳定性，与胶原蛋白的热稳定性相关[19]；ASC和PSC中均不含有Trp，且Cys、His和Thr的含量较低；除Cys、Val、Met外，青海牦牛骨PSC中的其他氨基酸含量均高于ASC。I型胶原蛋白中Gly、Pro和Hyp含量丰富，且Gly约占氨基酸总量的1/3，Cys、His、Thr和Trp的含量很低甚至没有[20]，因此推断牦牛骨ASC、PSC为I型胶原蛋白，且PSC的纯度相对较高。

2.2 紫外光谱分析

图1 青海牦牛骨胶原蛋白紫外光谱图Fig.1 UV absorption spectra of ASC and PSC

蛋白质分子中存在一些在紫外吸收区域有特征吸收的官能团，例如芳香族氨基酸残基一般在250～280 nm波长范围产生一个吸收峰；氨基酸残基、氢键或与螺旋等构象相关的次级键一般在210～250 nm的波长范围内产生吸收峰；而蛋白质分子中的肽键及某些与蛋白质构象相关因素一般会在210 nm波长以下产生吸收峰[21-22]。如图1所示，牦牛骨ASC和PSC两种胶原蛋白样品的紫外光谱特征基本一致，均在234 nm波长处达到最大吸收，与相关文献报道的在230 nm波长处具有最大吸光度相吻合，主要是肽键—C＝O的n→π*跃迁，是胶原蛋白三股螺旋结构的特征吸收峰[23-24]。

2.3 FTIR分析

使用Peakfit 4.2软件对ASC和PSC红外谱图中酰胺I带进行高斯拟合，得到多个子峰，进行峰位指认，各子峰峰位的谱带归属参考Choi等[25]的报道，将1 616～1 637 cm-1和1 681～1 700 cm-1归属为β-折叠，1 638～1 645 cm-1归属为无规则卷曲，1 646～1 664 cm-1归属为α-螺旋，1 665～1 681 cm-1归属为β-转角，并计算二级结构相对含量。

图2 青海牦牛骨胶原蛋白FTIR图Fig.2 FTIR spectra of ASC and PSC

图3 青海牦牛骨胶原蛋白中二级结构的相对含量Fig.3 Secondary structure composition of ASC and PSC

图2 为ASC与PSC的FTIR，经曲线拟合去卷积及峰位指认分析，二级结构相对含量如图3显示，青海牦牛骨ASC中的α-螺旋（66.7%）含量为PSC中的2.0 倍，ASC与PSC中的β-折叠分别为29.5%、41.2%，β-转角分别为3.8%和25.4%，二者均不含无规则卷曲，表明青海牦牛骨ASC和PSC三股螺旋结构完整。对特征吸收峰分析如表2所示。

表2 ASC和PSC特征吸收峰及产生原因[26-27]Table2 FTIR spectral peak locations and assignment of ASC and PSC[26-27]

由表2可知，青海牦牛骨ASC和PSC在3 400 cm-1左右为酰胺A带，是蛋白质的特征吸收峰；酰胺I带均出现在1 651.01 cm-1左右，是由胶原蛋白多肽骨架中C—O的伸缩振动所导致，与其二级结构有关；1 450～1 600 cm-1是酰胺II带的特征吸收频率，ASC仅在1 579.65 cm-1出现吸收峰；胶原蛋白中的Gly、Pro、Hyp含量相对较高，因此牦牛骨ASC和PSC在1 200～1 400 cm-1处具有独特的吸收峰，由C—N的伸缩振动和N—H的弯曲振动所引起，可以归属于Gly骨架和Pro侧链上CH2的摇摆振动峰；胶原蛋白红外光谱特征综合表明所提取的ASC和PSC保留了较为完整的三股螺旋结构。

2.4 DSC分析

图4 青海牦牛骨胶原蛋白热流分析Fig.4 Thermal analysis of ASC and PSC

通过DSC法分析青海牦牛骨ASC、PSC的热收缩温度（Ts）和变性焓值（denaturation enthalpy，DH）。加热会使胶原蛋白超螺旋结构中的氢键断裂，变性则形成无规则卷曲，并伴随着能量变化，同时也可以反映胶原蛋白螺旋结构及其生物活性的变化[28]。由图4可以看出，青海牦牛骨ASC和PSC的Ts分别是40.12 ℃和40.94 ℃，DH分别为0.25 J/g和0.22 J/g。推测这可能是因为牦牛骨ASC和PSC的提取温度相同，所以两者的Ts和DH无太大差别。

2.5 SDS-PAGE结果

如图5所示，PSC和ASC的基本组成大致相同，在高于250 kDa处是I型胶原蛋白α链的三聚体，即γ链，约200 kDa处有一条β条带，为α链的二聚体；在约110 kDa处有α1、α2两条电泳条带，与刘丽莉等[29]报道的一致。因此，判定所提取的胶原蛋白基本具有较为完整的三股螺旋结构。有研究表明高分子质量的γ与β链含量越高，胶原蛋白的凝胶强度就越低[30]，ASC的γ链和β链较浅较细，PSC的γ链较为明显，β链较多，表明ASC的凝胶性可能相对较好；ASC的α链条带相对浅细且无70 kDa以下的条带，可能是因为ASC的蛋白结构相对更完整，几乎不含有小分子的水解胶原蛋白及多肽；而PSC的α链以下有其他分子链条，说明在酶法提取的过程中，在酶的作用下可能使胶原蛋白降解成其他小分子，由此推断酸法提取的胶原蛋白比酶法提取的胶原蛋白的纯度更高。

图5 青海牦牛骨胶原蛋白SDS-PAGE结果Fig.5 SDS-PAGE analysis of ASC and PSC

2.6 微观结构观察结果

图6 青海牦牛骨胶原蛋白微观结构Fig.6 Microstructures of ASC (A) and PSC (B)

对牦牛骨中提取的ASC与PSC进行微观结构观察，结果如图6所示。ASC和PSC呈现出相对均一规则且光滑的多孔网络状结构，其孔径的大小可能与制备过程中的含水量有关[7,31]。其中，ASC结构分布相对均匀，说明在提取过程中基本没有破坏它本身的纤维结构，而PSC的孔径较多且分布不均匀，说明酶对胶原蛋白的结构有部分改变，但仍较好地保持了其网状结构，这一特征与温慧芳等[5]报道一致。通过对ASC和PSC的SEM图分析可知，胶原蛋白的提取方式不同，其结构也不尽相同；但这两种方法所提取的胶原蛋白都保留了较完整的纤维网络结构。

3 结 论

本实验分析对比了酸法、酶法提取牦牛骨胶原蛋白的理化特性得出以下结论：采用酸法从牛骨中提取胶原蛋白得率是2.24%，酶法胶原蛋白得率是3.32%，酶法较酸法提取率提高了48.21%，但酶法提取的成本较高；2 种方法提取的胶原蛋白都含有其特征性氨基酸，且Gly含量最多，PSC中氨基酸除Cys、Val、Met外，其他氨基酸含量均高于ASC，故推测PSC的纯度可能相对较高；酸法和酶法提取的胶原蛋白的紫外光谱基本一致，在230 nm左右波长处有最大紫外吸收峰，且在280 nm波长处未出现紫外吸收峰，说明牦牛骨ASC和PSC中均不含有Trp，是典型的胶原蛋白；Nagai等[32]研究表明胶原蛋白在水系中纤维的Ts可以反映其稳定性，Ts与胶原蛋白中亚氨基的含量呈正相关，本实验测得ASC和PSC的Ts分别为40.12 ℃和40.94 ℃，这可能是由于ASC和PSC的分子特性和构型存在差异；红外光谱及SDS-PAGE显示提取的胶原蛋白主要由α、β、γ三种亚基组分组成，属于I型胶原蛋白，且三股螺旋结构完整。ASC的γ链和β链较浅较细，α链条带相对浅细且无70 kDa以下的条带，可能是因为ASC的蛋白结构相对较为完整，含有较少小分子的水解胶原及多肽；牦牛骨ASC和PSC都保留了较为完整的纤维网状结构，两者呈现出相对统一规则的多孔网状结构，但酸法提取胶原蛋白结构分布相对均匀，推测其孔径的大小可能与制备过程中含水量有关。

[1] FERREIR A M, GENTILE P, CHIONO V, et al. Collagen for bone tissue regeneration[J]. Acta Biomaterialia, 2012, 8(9): 3191-3200.DOI:10.1016/j.acrbio.2012.06.014.

[2] OGAWA M, PORTIER R J, MOODY M W, et al. Biochemical properties of bone and scale collagens isolated from the subtropical fish black drum (Pogonia cromis) and sheepshead seabream(Archosargus probatocephalus)[J]. Food Chemistry, 2004, 88(4): 495-501. DOI:10.1016/j.foodchem.2004.02.006.

[3] 张达江, 王亮. I型胶原蛋白的结构、功能及其应用研究的现状与前景[J]. 生物技术通讯, 2006, 17(2)∶ 265-269.

[4] KUOJUNG G L, COLLIN M S. Insight into the degradation of type-I collagen fibrils by MMP-8[J]. Journal of Molecular Biology, 2013,425(10): 1815-1825. DOI:10.1016/j.jmb.2013.02.002.

[5] 温慧芳, 陈丽丽, 白春清, 等. 基于不同提取方法的鮰鱼皮胶原蛋白理化性质的比较研究[J]. 食品科学, 2016, 37(1)∶ 74-81.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201601014.

[6] 刘苏锐, 王坤余, 琚海燕. 猪皮I型胶原蛋白的提取及其结构表征[J].中国皮革, 2007, 36(7)∶ 43-46.

[7] 何兰. 牛骨胶原蛋白的提取及复合海绵的制备研究[D]. 武汉∶ 华中农业大学, 2012∶ 36-47.

[8] 刘静. 牦牛骨胶原多肽螯合钙的制备研究[D]. 雅安: 四川农业大学,2016: 9-13.

[9] LANG Y, SHA K, ZHANG R, et al. Effect of electrical stimulation and hot boning on the eating quality of Datong yak longissimus lumborum[J]. Meat Science, 2016, 112(4): 3-8. DOI:10.1016/j.meatsci.2015.10.011.

[10] CHEN C, HAN L, YU Q L, et al. Color stability and antioxidant capacity of yak meat as affected by feeding with pasture and grain[J]. Canadian Journal of Animal Science, 2015, 95(2): 189-195.DOI:10.4141/cjas-2014-129.

[11] 崔刚, 陆天才, 李洪安, 等. 牦牛皮胶氨基酸矿物质元素分析与评价[J].现代科学仪器, 2006(3)∶ 50-51.

[12] 吴婷, 贾伟, 管声, 等. 5 个品种牛骨的营养组成及其含量差异分析[J]. 食品工业科技, 2017(2)∶ 342-348. DOI∶10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.058.

[13] 陈丽丽. 鮰鱼皮中胶原蛋白的提取、性质及应用研究[D]. 南昌∶ 江西科技师范大学, 2012∶ 10-21.

[14] CAPUTO I, LEPRETTI M, SCARABINO C, et al. An acetic acidbased extraction method to obtain high quality collagen from archeological bone remains[J]. Analytical Biochemistry, 2012, 421(1)∶92-96. DOI∶10.1016/j.ab.2011.10.024.

[15] 倪娜. 羊血浆蛋白∶ 肌原纤维蛋白复合凝胶形成的作用分析[D].北京∶ 中国农业科学院, 2014∶ 27-30.

[16] LAEMMLI U K. Cleavage of structural proteins during assembly of the head bacteriophage T4[J]. Nature, 1970, 227(5259)∶ 680-685.DOI∶10.1038/227680a0.

[17] PALKA K, DAUN H. Changes in texture, cooking losses, and myof i brillar structure of bovine M. semitendinosus during heating[J].Meat Science, 1999, 51(3)∶ 237-243. DOI∶10.1016/S0309-1740(98)00119-3.

[18] BAE I, OSATOMI K, YOSHIDA A, et al. Biochemical properties of acid-soluble collagens extracted from the skins of underutilized fishes[J]. Food Chemistry, 2008, 108(1)∶ 49-54. DOI∶10.1016/j.foodchem.2007.10.039.

[19] SHOULDERS M D, RAINES R T. Collagen structure and stability[J].Annual Review of Biochemistry, 2009, 78(78): 929-958. DOI:10.1146/annurev.biochem.77.032207.120833.

[20] KITTIPHATTANABAWON P, NALINANON S, BENJAKUL S, et al.Characteristics of pepsin-solubilised collagen from the skin of splendid squid (Loligo formosana)[J]. Journal of Chemistry, 2015, 2015∶ 1-8.DOI∶10.1155/2015/482354.

[21] 刘龙天. 胶原蛋白三螺旋结构及热稳定性的研究[D]. 北京∶ 北京协和医学院, 2009∶ 7-28.

[22] DUAN R, ZHAN J, DU X, et al. Properties of collagen from skin,scale and bone of carp (Cyprinus carpio)[J]. Food Chemistry, 2009,112(3): 702-706. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.06.020.

[23] NALINANON S, BENIAKUL S, KISHIMURA H, et al. Type I collagen from the skin of ornate threadf i n bream (Nemipterus hexodon):characteristics and effect of pepsin hydrolysis[J]. Food Chemistry,2011, 125(2): 500-507. DOI:10.1016/j.foodchem.2010.09.040.

[24] AHMAD M, BENJAKUL S. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from the skin of unicorn leatherjacket(Aluterus monocerous)[J]. Food Chemistry, 2010, 120(3): 817-824.DOI:10.1016/j.foodchem.2009.11.019.

[25] CHOI S M, MA C Y. Conformational study of globulin from common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) by Fourier transforminfrared spectroscopy and differential scanning calorimetry[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005,53(20): 8046-8053. DOI:10.1021/jf051040v.

[26] TU A. Raman spectroscopy in biology[M]. New York: John Wiley,1982: 33-40.

[27] LIU D, LIANG L, REGENSTEIN J M, et al. Extraction and characterisation of pepsin-solubilised collagen from fins, scales,skins, bones and swim bladders of bighead carp (Hypophthalmichthys nobilis)[J]. Food Chemistry, 2012, 133(4): 1441-1448. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.02.032.

[28] ZHANG Y, LIU W, LI G, et al. Isolation and partial characterization of pepsin-soluble collagen from the skin of grass carp (Ctenopharyngodon idella)[J]. Food Chemistry, 2007, 103(3)∶ 906-912. DOI∶10.1016/j.foodchem.2006.09.053.

[29] 刘丽莉, 马美湖, 杨协力. 牛骨I型胶原蛋白提取及结构表征[J]. 食品科学, 2010, 31(2)∶ 87-91.

[30] 刘海英. 斑点叉尾鮰鱼皮胶原蛋白及胶原蛋白多肽的研究[D]. 无锡∶ 江南大学, 2007∶ 6-23.

[31] MATMAROH K, BENJAKUL S, PRODPRAN T, et al. Characteristics of acid soluble collagen and pepsin soluble collagen from scale of spotted golden goatfish (Parupeneus heptacanthus)[J]. Food Chemistry, 2011,129(3): 1179-1186. DOI:10.1016/j.foodchem.2011.05.099.

[32] NAGAI T, ARAKI Y, SUZUKI N. Collagen of the skin of ocellate puffer fi sh (Takifugu rubripes)[J]. Food Chemistry, 2002, 78(2): 173-177. DOI:10.1016/S0308-8146(01)00396-X.