王燕 李蒙英 曲军辉 倪腾飞 谢立群

摘 要：随着水体污染的日趋严重，水生植被特别是沉水植被的衰退和消失是世界范围内的普遍现象，为探究其退化与除草剂的相关性，采用水培试验方法，研究不同浓度苯达松对轮叶黑藻植株叶绿素含量和2种抗氧化酶活性，以及丙二醛（MDA）、可溶性蛋白（SP）及脯氨酸（Pro）含量的影响。结果表明，苯达松可以抑制轮叶黑藻叶绿素a的合成，促进叶绿素b的合成（除4.0 mg·L-1处理外），叶绿素总量随苯达松浓度增加而下降，降低了植物体光合能力；在试验浓度范围内，过氧化物酶（POD）活性先升高后降低，超氧化物歧化酶（SOD）活性在0.1，0.2，1.0 mg·L-1處理呈先升后降的趋势，而在0.5，2.0，4.0 mg·L-1处理及CK呈降低-升高-降低的趋势；处理后第10天，随着苯达松浓度的增加，轮叶黑藻体内丙二醛（MDA）含量先升后降，至0.5 mg·L-1达到最高，可溶性蛋白（SP）含量显著下降，而脯氨酸（Pro）含量显著升高。上述结果均说明苯达松影响了轮叶黑藻正常的生理代谢活动。

关键词：轮叶黑藻；苯达松；胁迫；生理特性

中图分类号：S963.22+1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2018.05.003

Abstract： As the pollution of water has becoming more and more serious， the decline and disappearance of aquatic vegetation especially submerged vegetation was a worldwide phenomenon. In order to explore the correlation between aquatic vegetation degradation and herbicide， the hydroponics method was used in this experiment， and the effects of different concentrations of bentazon on physiological characteristics of Hydrilla verticillatai were studied， including chlorophyll content， two kinds of antioxidant enzyme activities， and the content of malondialdehyde （MDA）， soluble protein （SP） proline （Pro） in the plant. The results showed that the biosynthesis of chlorophyll a were inhibited， while the synthesis of chlorophyll b （except 4.0 mg·L-1treatment） were promoted by bentazon. Following with the increasing of bentazon concentration， the total chlorophyll content decreased， indicating the photosynthetic capacity was reduced. In the experiment， the activity of peroxidase （POD） at all the treatments， and the activity of superoxide dismutase （SOD） at 0.1， 0.2 mg·L-1 treatments were showing the same trend that first increased and then decreased， while the activity of superoxide dismutase （SOD） at 0.5， 2， 4 mg·L-1 treatment and CK showed a trend of decreasing - increasing - decreasing. Following with the increasing of bentazon concentration， the content of malondialdehyde increased first and then decreased， the soluble protein content decreased significantly， while the proline content increased significantly.

Key words： Hydrilla verticillatai； bentazon； stress； physiological characteristics

苯达松作为国内外应用很广的一种除草剂，进入我国农药市场达30多年，其销量稳中有升。全球范围内，苯达松残留不仅存在于土壤和农作物中，也随着地表径流进入湖泊、河流等水域中[1-2]，给水环境带来了一定的污染。在世界水稻种植地区进行的研究中提到，由于苯达松对土壤极低的吸附能力和较高的流动性，其在地表和地下水中的含量最为常见。沉水植物的生活周期主要在水层下方，生理上极端依赖水环境，因而对环境胁迫的反应极为敏感[3]，目前，由于水生态环境的恶化，造成沉水植物退化加剧，对其退化原因的研究主要集中在水体的富营养化及重金属[4-5]等方面，但与除草剂污染的相关性研究较少。轮叶黑藻为多年生沉水植物，在水体景观应用广泛，且常用于水体净化。本试验以轮叶黑藻为试验材料，研究它对苯达松胁迫的耐受性，以期为除草剂残留情况下沉水植物的退化原因提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试药品，苯达松，纯度99.5%标准品，由上海市农科院植保所提供。用乙醇配制1 000 mg·L-1苯达松溶液，储存于冰箱中备用。沉水植物轮叶黑藻采自苏州大学独墅湖校区池塘，将采集的植物材料置于含有1/10的霍格兰氏改良液塑料容器中，在实验室适应性培养2周；选择一定量生长良好、生长状况一致的植物个体，分成14等份，清水洗净后植于含有培养液500 mL的三角瓶中，置于光照培养箱中驯化1周。

1.2 处理方法

采用室内水培试验，将驯化好的植物分别置于14个500 mL盛有培养液的三角瓶中，其中苯达松浓度分别为0（CK），0.1（A），0.2（B），0.5 （C），1.0（D），2.0（E），4.0 mg·L-1（F），每个处理设2个平行，培养箱温度为22～26 ℃，光暗比为14/10，定期添加蒸馏水以补充挥发的水分。试验周期为10 d，分别在处理的第3，6天测定不同处理组植株叶绿素含量；在处理的第0，2，4，6，8，10天测定丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量以及过氧化物酶（Peroxidase，POD）活性、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性；在试验结束时测定可溶性蛋白（Soluble protein，SP）及脯氨酸（Proline，Pro）含量。

1.3 试验方法

叶绿素含量的测定采用丙酮乙醇混合液法，丙二醛（MDA）含量的测定采用硫代巴比妥酸显色法，过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定，超氧化物歧化酶（SOD）活性采用氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定，可溶性蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250法，脯氨酸的测定采用酸性茚三酮显色法[6]。每次测定重复3次，取平均值。

1.4 数据处理和统计分析

数据处理及绘图采用Microsoft Excel 2016，数据统计分析采用SPSS 17.0软件，多重比较采用LSD最小显著差数法[7]。

2 结果与分析

2.1 不同浓度苯达松对叶绿素含量的影响

从表1可知，处理后第3天，各处理轮叶黑藻叶绿素总量均显著低于CK，且随着苯达松浓度的增加，叶绿素总量呈先升后降的趋势，处理A、B、C、D、E、F分别为CK的96.73%，98.94%，99.38%，99.04%，96.97%，87.89%，至0.5 mg·L-1（C处理）达到最大值。处理后第6天，各处理轮叶黑藻叶绿素总量亦显著低于CK，且随着苯达松浓度增加，叶绿素总量呈持续下降的趋势，处理A、B、C、D、E、F分别为CK的95.86%，95.20%，94.79%，93.97%，84.67%，38.22%。说明随着处理时间的延长，苯达松对轮叶黑藻叶绿素总量产生持续的影响。无论是处理3 d还是6 d，各处理组轮叶黑藻叶绿素a含量均随处理浓度增加呈现逐渐下降趋势，而叶绿素b含量则呈逐渐增加趋势，至4.0 mg·L-1（F处理）急剧下降。表明营养液中苯达松浓度的加大抑制轮叶黑藻叶绿素a的合成，却促进叶绿素b的合成，当浓度达到4.0 mg·L-1时， 叶绿素a和b的合成均受到抑制，因此各处理叶绿素a/b在第6天时均低于CK，而在第3天时4.0 mg·L-1（F处理）高于CK，其他处理均低于CK。

2.2 不同浓度苯达松对丙二醛（MDA）含量的影响

从图1可知，轮叶黑藻的MDA含量随苯达松浓度的增加均有不同程度增加，且都高于对照，表明，苯达松胁迫刺激轮叶黑藻MDA含量的升高。当苯达松浓度≤0.5 mg·L-1时，各处理MDA含量在同一测定时间内表现出一定的剂量-效应关系，即浓度越高，MDA含量也越高；随着胁迫时间的延长，MDA含量逐渐增加至第10天时达到最大值，处理A、B、C组MDA含量分别是CK的1.18，1.22，1.26倍，各处理间及其与CK之间差异均达显著水平。当苯达松浓度≥1.0 mg·L-1时，随着胁迫时间的延长，轮叶黑藻MDA含量呈先升后降趋势，处理D、E、 F分别于第2，6，6天达到最大值，其最大值分别为CK的1.14，1.23， 1.14倍。

2.3 不同浓度苯达松对SOD和POD活性的影响

2.3.1 不同浓度苯达松对SOD活性的影响 从图2可知，随着处理时间的延长，A、B、D处理SOD活性呈先升后降的趋势，而C、E、F处理及CK呈降低-升高-降低的趋势。第2天时，各处理组轮叶黑藻SOD活性均显著低于对照CK，且随着苯达松浓度增加，SOD活性呈先降后升的趋势，至D处理达到最低值；第4天 时，A、B处理显著高于CK，C、E、F处理显著低于CK，D处理与CK差异不显著；第6，8天，A、B、E、F处理均显著高于CK，而C、D处理与CK差异不显著；第10天，E、F处理显著高于CK，其他处理与CK之间差异不显著。

2.3.2 不同浓度苯达松对POD活性的影响 从图3可知，在各处理时间，随着苯达松浓度的增加，轮叶黑藻POD活性呈先升后降趋势，其中第2天和第4天至0.5 mg·L-1（C处理）达到最大值，而第6，8，10天则于0.2 mg·L-1（B处理）达到最大值；第2，4，6天时，各处理组POD活性均显著高于CK，第8天时，除E和F组外其他处理POD活性均显著高于CK，第10天时，D、E和F组显著低于CK而其他3组显著高于CK。随着处理时间的延长，各处理组轮叶黑藻POD活性均呈现先升高后下降的趋势，A、B、C、D、E、F组分别于第2，6，4，4，2，2天達到最大值。试验结束时，处理A、B、C、D、E、F组POD活性分别为CK的1.41，1.66，1.09，0.66，0.51，0.24倍，可能有害物引起轮叶黑藻植物体一定程度的损伤，从而导致POD活性降低。

2.4 不同浓度苯达松对可溶性蛋白含量（SP）的影响

从图4可知，各处理组轮叶黑藻植株SP含量均显著低于CK，且随着苯达松浓度的增加，SP含量逐渐下降，处理A、B、C、D、E和F组分别为CK的90.17%，93.61%，60.78%，57.75%，52.51%，50.54%，其中处理A和B、E和F差异均不显著，其他各组间差异均达显著水平。

2.5 不同浓度苯达松对脯氨酸（Pro）含量的影响

从图5可知，各处理轮叶黑藻植株Pro含量均显著高于CK，且随着苯达松浓度增加， Pro含量逐渐上升。处理A、B、C、D、E和F组分别为CK的1.14，1.11，1.25，1.54，1.58，1.77倍，其中处理A和B、D和E之间差异均不显著，其他各处理间差异均达显著水平。

3 讨论和结论

叶绿素是植物体进行光合作用的主要色素，其含量高低在一定程度上反映了光合作用水平。叶绿素含量低，光合作用弱，使植物不能正常代谢，从而导致植物鲜质量降低[8]。高等植物参与光合作用的主要色素包括叶绿素a和叶绿素b，叶绿素a/b值的变化，能反映叶片光合活性的强弱[9]。许多研究表明，逆境胁迫都能引起叶绿素破坏，光合性能下降[10]。Wu C M等[11]研究表明，苯达松对植物影响的作用机理主要是抑制其光合作用。本试验中，随着苯达松处理浓度的增加，轮叶黑藻叶绿素总量逐渐降低（表1），其中叶绿素a含量降低，而叶绿素b含量增加（除4.0 mg·L-1之外），导致最终除第3天时4.0 mg·L-1（F处理）外，其他各处理轮叶黑藻叶绿素a/b均显著低于对照，说明其光合作用受到抑制，表现出明显的毒害症状。

植物器官衰老或在逆境条件下，会发生膜脂过氧化作用，MDA是膜脂过氧化的最终分解产物，能与细胞内的各种物质发生强烈反应，引起对酶和膜的严重损傷，其含量水平通常可反映植株遭受氧化胁迫的程度[12]。本试验中，随苯达松胁迫浓度的增加，轮叶黑藻的MDA含量均有不同程度增加，推测在苯达松胁迫过程中，可能产生大量活性氧、自由基引发膜质过氧化作用，使植株膜的正常结构和功能受损，这与吴永波等[13]的研究结果一致；当苯达松浓度≤0.5 mg·L-1时，随着浓度增加和胁迫时间延长，轮叶黑藻MDA含量呈增加趋势，说明培养液中苯达松可能对轮叶黑藻的细胞质膜造成了一定的损伤，且随着时间延长损伤程度加剧；而当浓度≥1 mg·L-1时，随着胁迫时间延长，轮叶黑藻MDA含量先扬后抑，可能是对轮叶黑藻植株造成不可逆的损伤，从而使MDA含量含量降低。

在逆境胁迫条件下，SOD和POD活性的变化可以反映细胞清除活性氧的能力，二者在植物的抗逆性研究中颇受重视，在许多植物研究中均有报道[12，14]。SOD是一种典型的诱导酶，能催化超氧阴离子自由基的歧化反应而形成O2和H2O2，从而减轻O2-对植物的毒害[15]，其活性变化在一定程度上反映了植株受胁迫程度。本试验中，第2天各处理以及第4天的C、E、F处理轮叶黑藻SOD活性均被显著抑制，可能是因为轮叶黑藻植物体在受到苯达松胁迫时，对有害胁迫产生一定的适应阶段；第4天的A、B、D处理以及第6天和第8天各处理，轮叶黑藻对有害物产生应激反应，SOD活性被诱导，表现为各处理SOD活性增加；第10天当苯达松浓度≤1.0 mg·L-1时，轮叶黑藻SOD活性与CK差异不显著，而浓度≥2 mg·L-1时SOD活性仍显著高于CK，可能是轮叶黑藻SOD对一定浓度的苯达松胁迫产生一定的耐受性，而超过耐受范围则造成轮叶黑藻活性氧过高。POD是抗氧化系统中的重要保护酶，可有效地清除各种环境胁迫下植物体内产生的活性氧，从而阻止膜脂过氧化的进程，以降低胁迫对植物的毒害，维持质膜透性及自由基之间的动态平衡，保证植物进行正常的新陈代谢功能[16]。正常情况下，植物体内POD活性维持一定水平，以去除不断产生的活性氧，使植物体内POD活性和活性氧含量达成一定平衡关系[17]。许多研究[18-19]都表明，植物体内POD活性变化存在先扬后抑的过程，即在轻度胁迫下，植物体本身能提高等保护酶活性，以清除有害物质，但随着胁迫的加强，最终导致活性下降。在本试验中， 轮叶黑藻中POD活性亦表现为存在先扬后抑，也证明了上述结论。

生物体在正常代谢过程中，可通过有机渗透调节物质的积累和分解来调节细胞渗透平衡，从而缓解盐胁迫对植物的伤害。脯氨酸和可溶性蛋白以作为细胞质的渗透调节物质和防脱水剂参与维持细胞的含水量和膨压；此外脯氨酸可以改善细胞膜和其他高分子物质的水环境，增强细胞结构的稳定性[20]。本试验中，随着苯达松浓度的增加，轮叶黑藻SP含量显著下降，可能是因为苯达松对植物细胞的核糖体造成损伤，影响蛋白质合成；而Pro含量呈逐渐升高的趋势，表明在一定浓度范围内，轮叶黑藻可以通过细胞内Pro的积累来抵御胁迫，这与高青海等[21]在外源褪黑素对甜瓜幼苗影响中的研究结果类似，说明轮叶黑藻可以通过提高脯氨酸的含量提高细胞的渗透势，维持细胞代谢，从而提高其抗逆性。

参考文献：

[1]王点点， 石利利， 宋宁慧. QuEChERS-高效液相色谱法测定稻田土壤、稻米和秸秆中的灭草松残留[J].分析试验室， 2012， 31（6）：1-5.

[2]周珊， 雒丽娜， 马腾蛟， 等. 气相色谱法测定饮用水及其源水中灭草松和2，4-滴[J]. 分析试验室， 2007， 26（3）：84-87.

[3]WANG J， GU Y F， JI D C， et al. Effects of different form of nitrogen on Hydrilla verticillata under eutrophic condition [J]. Research of environmental science， 2006， 19（1）： 71-74.

[4]孔范龙， 郗敏， 徐丽华， 等. 富营养化水体的营养盐限制性研究综述[J]. 地球环境学， 2016， 7（2）： 121-129.

[5]牛海根.水体重金属污染现状及其治理技术[J]. 资源节约与保护， 2016 （12）： 185-185.

[6]李合生. 植物生理生化试验指导[M]. 北京：高等教育出版社， 2000： 164-167.

[7]惠凤莲. 论多重比较的集中方法[J]. 统计与信息论坛， 1997（4）：30-34.

[8]夏卓英， 张明强， 王良峰. 不同浓度Pb（Ⅱ）对稀脉萍和紫萍的毒性效应[J]. 环境科学与技术， 2009， 32（6）： 123-129.

[9]何军， 许兴， 李树华， 等. 水分胁迫对牛心朴子叶片光合色素及叶绿素荧光的影响[J]. 西北植物学报， 2004， 24（9）： 1594-1598.

[10]王立丰， 李良壁， 白克智， 等. 高浓度LaCl3抑制黄瓜（Cucumis sativus Linn）光系统II（PS II）活性[J]. 中国稀土学报， 2005， 23（6）： 770-774.

[11]WU C M ， WANG C Y . Physiological study on bentazon tolerance in inbred corn （Zea mays）[J].Weed technology， 2003， 17（3）：565-570.

[12]DIXIT V， PANDEY V， SHYAM R. Differential antioxidative responses tocadmium in roots and leaves ofpea （Pisum sativum L. Cv . Azad）[J]. Journal of experi-mental botany， 2001， 52： 1101-1109.

[13]吳永波， 叶波. 高温干旱复合胁迫对构树幼苗抗氧化酶活性和活性氧代谢的影响[J]. 生态学报2016，36（2）：403- 410.

[14]刘宛， 李培军， 周启星. 氯苯类胁迫对蚕豆幼苗超氧化物歧化物活性的影响[J]. 农业环境科学学报， 2004， 23（3）： 432-436.

[15]SHALATA A， NEUMANN P M. Exogenous ascorbic acid （vitaminC） increases resistance to salt stress and reduces lipid peroxidation[J]. J exp bot， 2001， 52（364）： 2207-2211.

[16]金明红， 冯宗炜， 张福珠. 臭氧对水稻叶片膜脂过氧化和抗氧化系统的影响[J]. 环境科学， 2000， 21 （3）：1-5.

[17]杨淑慎， 高俊风. 活性氧、自由基与植物的衰老[J]. 西北植物学报， 2001， 21（2）： 215-220.

[18]蒋明义，荆家海，王韶唐.渗透胁迫对水稻幼苗膜脂过氧化及体内保护系统的影响[J]. 植物生理学报， 1991（1）：80-84.

[19]苏金为， 王湘平. 镉诱导的茶树苗膜脂过氧化和细胞程序性死亡[J]. 植物生理与分子生物学学报， 2002， 28（4）： 292-298.

[20]彭克勤， 胡家金. 渗透胁迫下植物脯氨酸积累的研究进展[J]. 中国农学通报， 2002， 18（4）： 80-83.

[21]高青海， 贾双双， 苗永美. 亚低温条件下外源褪黑素对甜瓜幼苗氮代谢及渗透调节物质的影响[J]. 应用生态学报， 2016， 27（2）： 519-524.