杨军 王艳菊 白永文 张江荣

摘 要：玛咖中含有多种大量的玛咖酰胺，不同玛咖酰胺具有不同的作用，将其有效分离并应用于不同领域是发挥玛咖作用的主要途径。工业生产研究过程中曾尝试多种不同的方法，但是不同的分离方法均具有不同的优劣势，应用效果欠佳。本文主要就高效液相色谱法分离5种玛咖酰胺的基本情况进行了分析。

关键词：玛咖酰胺；高效液相色谱法；含量检测

中图分类号：S567.2 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20180432013

玛咖主要产于云南迪庆、丽江等高原地区，是一种非常独特的高原农作物，具有增強体力、内分泌调节、抗氧化、抗衰老的功能，是近些年来发现并广泛应用的营养保健产品。玛咖中含有大量有价值成分，包括蛋白质、维生素、氨基酸、玛咖烯及玛咖酰胺等，其中玛咖酰胺是最为主要的功能成分，其含量的高低是决定玛咖价值的关键因素，如何将玛咖酰胺从玛咖中分离出来、选择何种安全且高效的分离方法是当前生产研究面临的重大难题。

1 高效液相色谱法分离玛咖酰胺实验过程

1.1 实验仪器与试剂

仪器主要有岛津LC-20A高效液相色谱仪-配置紫外检测器、RE 2000A旋转蒸发器、FRQ-1004DHT型超声清洗器、TDL-40C型低速台式大容量离心机等。

试剂主要有间甲氧基-苄基-亚麻酰胺、苄基-亚麻酰胺、间甲氧基-苄基-亚油酰胺、苄基-亚油酰胺、苄基-十六烷酰胺5种玛咖酰胺对照品（纯度98%以上），乙腈（色谱纯），甲酸（色谱纯，美国天地有限公司），石油醚（分析纯，沸程60～90℃）。

1.2 液相色谱条件

Waters XTerra C18（规格为250mm×4.6mm，5μm）色谱柱，保持柱温30℃，乙腈：0.2%甲酸水90：10，等度洗脱，流动相流速1.0 mL/min，紫外检测波长 210nm，单次进样量10μL。

1.3 液相质谱联用条件

选择电喷雾离子源ESI，采用正负离子进行扫描，将毛细管电压维持在4500V，选择氮气为干燥气体流量为15L/min，去溶剂温度为250℃，维持0.7MPa的喷雾器压力，进行多反应监测。

1.4 对照品溶液的制备

利用分析天平称取适量的5种玛咖酰胺对照品将其置于250mL的容量瓶中，选择配比好的乙腈溶液溶解后定容，然后从每份制备好的对照品分别取1.0mL、0.8mL、0.6mL、0.4mL、0.2mL及0.1mL的溶液，置于10mL容量瓶中，选用乙腈溶液进行定容，摇匀后共得到30种不同浓度、不同种类的玛咖酰胺对照品溶液。

1.5 样品溶液的准备

选择市面上常见的玛咖干制品，粉碎后过50目筛，备用。利用电子天平精密称取粉末1.5g，置于50mL的圆底烧瓶中，加入50.0mL石油醚（保证玛咖粉末能够完全浸没于石油醚中），将圆底烧瓶置于合适大小的电热套中，安装回流管回流提取约6h，将提取液和玛咖渣一同倒入50mL离心管中，5000rpm离心10min。将上清液进行旋蒸，使石油醚与玛咖酰胺进行分离，选用乙腈溶液将提取物溶解定容至5mL，并利用0.22μm一次性过滤器进行过滤，得到5种玛咖酰胺的样品提取物。

2 条件优化和方法评价

2.1 色谱条件优化

对比不同流动相下玛咖酰胺的分离效果，当选择乙腈-水作为洗脱相时，玛咖酰胺分离效果的最佳，而在洗脱液中添加0.2%的甲酸溶液会得到较为对称玛咖酰胺质谱峰型，因此应当选择乙腈-水（0.2%甲酸溶液）作为首选洗脱溶液。

2.2 紫外检测波长的选择

针对不同波长下的玛咖酰胺光谱情况进行选择，当波长在200nm时玛咖酰胺的响应强度较高，但是基线漂移现象较为严重，因此210nm紫外光线下检测光谱效果最佳。

2.3 柱温及流速条件

经过多次试验发现，当柱温在30℃，洗脱液流速维持1.0mL/min时，5种种类的玛咖酰胺才能完全实现基线分离，在光谱上完全展示出来，而且能够有效缩短玛咖酰胺分离的时间，避免长时间的分离过程中玛咖酰胺溶解于洗脱液中，影响其含量及纯度。

2.4 方法学考察

当所有检测分离条件完成优化后，选择混合对照品溶液，按照最佳的色谱条件进行测定，分析对照品溶度与峰面积之间的线性关系，并将对照品溶液按照不同的信噪比进行稀释，确定其检出限和定量限。

2.5 精密度实验

将不同种类的玛咖酰胺对照品溶液选择高、中、低3种浓度，在同样的色谱条件下，重复进样6次，将不同时间段进样得到的实验结果进行比较，比较峰面积的大小，若是5种玛咖酰胺不同浓度点RSD下于1.0%，则说明玛咖酰胺提取物纯度较高，采用的分离检测方法效果显著，精密度良好。

2.6 稳定性实验

通过稳定性试验来检验利用高效液相色谱法分离的效果，将提取的玛咖酰胺溶液连续3d，在同样色谱条件下进样检测3次，分析比较不同时间的峰面积，当面积差异小于0.5%时说明提取物稳定性良好。

2.7 回收实验

利用电子天平精密称取已知含量的同一批次玛咖样品1g，样品处理后按高中低3个水平分别加入对照品。进样分析，每个样品重复3次，计算峰面积的RSD。

3 实验结果

3.1 玛咖酰胺提取物的紫外色谱图

玛咖酰胺提取物在210nm色谱条件下，得到图1，色谱条件与上文中列出的条件相同。

玛咖酰胺提取物的色谱出峰顺序及时间为间甲氧基-苄基-亚麻酰胺15.003min，苄基-亚麻酰胺15.659min，间甲氧基-苄基-亚油酰胺19.846min，苄基-亚油酰胺20.828min，苄基-十六烷酰胺28.022min。

3.2 5种玛咖酰胺线性关系、检测限和定量限分析结果详见表1。

3.3 5种玛咖酰胺的回收率和准确度结果详见表2。

4 结语

本文主要分析了利用高效液相色谱法分离玛咖中5种玛咖酰胺的效果，方法操作简便、分离效果良好，同时利用质谱验证方法确定了5种玛咖酰胺的类型，根据色谱特点和质谱特点能够有效判断玛咖酰胺的结构类型；同时本研究采用方法学考察、精密度实验等多种方法验证了高效液相色谱分离法的价值，实验结果表明高效液相色谱分离法应用价值高，广泛应用于玛咖产品质量的检测中，该方法具有操作简便、准确性高、高效安全的特点。

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