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(1.广西大学动物科技学院， 广西 南宁 530004；2.广西玉林市动物卫生监督所)

犬瘟热(Canine distemper , CD) 是由副粘病毒科副粘病毒亚科麻疹病毒属的犬瘟热病毒( Canine distemper virus, CDV) 引起的一种累及犬科和其他食肉目动物的高度接触传染性、致死性传染病。在临床上以双相热、卡他性鼻炎以及随后引起支气管炎、卡他性肺炎、严重胃肠炎和神经症状等为主要特征，且容易继发其它病毒或细菌的混合感染和二次感染。发病率几乎达100%，死亡率达30%～80%不等，素有“毁灭性传染病”之称。犬瘟热病毒为单股不分节段的、非重叠的负链RNA病毒。病毒粒子中的主要蛋白有核衣壳蛋白(N)、磷蛋白(P)、大蛋白(L)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、附着蛋白或血凝蛋白(H)。N蛋白是CDV中含量最高的结构蛋白，N蛋白构成螺旋状的壳体，供RNA结合。N蛋白是具有免疫原性的保守结构蛋白。N蛋白上含有B淋巴细胞抗原表位，在细胞免疫方面有着重要作用；且N蛋白与病毒的毒力密切相关，在病毒感染时可引起强烈的抗体反应，尤其在感染初期F和H蛋白特异性抗体低于检测水平时，N蛋白特异性抗体仍能被检出。因此，N蛋白在犬瘟热诊断上具有重要意义。本研究旨在克隆CDV-N截短体基因，并构建其原核表达产物，纯化CDV-截短体蛋白，为制备CDV单克隆抗体和胶体金诊断试纸条奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与质粒

感受态细胞DH5α和BL21，pMD18T-CDV-N和 pET30a质粒为本实验室保存，pMD18-T质粒购自大连宝生物公司。

1.2 主要试剂

LA Taq 酶、DNA marker购自大连宝生物公司，限制性内切酶Bam HⅠ、HimdⅢ、T4 DNA连接酶、蛋白预染marker 购自Fermentas 公司，鼠源性His标签单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG 购自北京康为公司； Ni-NTA agarose购自德国Qiagen公司。

1.3 CDV-N截短体基因克隆

CDV-N基因全长1572bp，共编码523个氨基酸。用DNAStar 软件预测CDV-N588蛋白B细胞抗原表位，选择其中抗原表位集中的一段(氨基酸位点：328-523)用于原核表达。用Primer Premier 5.0软件设计CDV-N截短体上游引物 5'-TATGGATCCTCCTACCCACTGCTCT-3' 及下游引物 5'-CCCAAGCTTATTGAGTAGCTCTCTATC-3'。上游引物中引入BamH I 酶切位点，下游引物中引入Hind III 酶切位点(下划线部分)，预期扩增片段长度为588 bp。引物由广州invitogen公司合成。以pMD18T-CDV-N 质粒为模板，PCR 扩增CDV-N截短体基因。 PCR 反应体系：LA Taq 0.5 μL 10×LA PCR Buffer 5 μL, dNTP 8μl, 模板1μL ，上、下游引物(25μM)各1 μl ，加水至50μl。 PCR 反应条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，共30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，进行胶回收。胶回收产物与pMD18-T 载体16℃连接过夜，转化感受态细胞DH5α，LA 平板培养过夜，挑斑、增菌，小提质粒进行酶切鉴定。阳性质粒送广州invitogen公司测序。测序正确的质粒命名为pMD18T-CDV-N588。

1.4 CDV-N截短体基因原核表达载体构建

对pMD18T-CDV-N588和pET30a质粒用限制性内切酶Bam H Ⅰ和Himd Ⅲ 分别双酶切 ，分别胶回收CDV-N588片段和线性化的pET30a，T4 DNA连接酶16℃连接过夜, LA 平板培养过夜，挑斑、增菌，小提质粒进行酶切鉴定。阳性质粒送广州invitogen公司测序。测序正确的质粒命名为pET30a-CDV-N588。

1.5 His-CDV-N588 融合蛋白在大肠杆菌中的诱导表达

将酶切鉴定为阳性的重组质粒pET30a-CDV-N588转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，涂板，37℃培养过夜。挑取单个菌落，加入含有50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃振荡培养(220 rpm )过夜。取重组菌按1∶50的体积比转接入含50 mg/L卡那霉素的15 mL LB培养基中，振荡培养至OD600=0.8 时，取少量菌液作为阴性对照，剩余菌液中加入终浓度为1 mmol/L的IPTG，在37℃中诱导表达4 h。收集菌液进行SDS-PAGE电泳分析。

1.6 His-CDV-N588 融合蛋白纯化

将重组菌按1∶50的体积比对接1000 mL含50 mg/L 卡那霉素的LB培养基中，37℃恒温摇床培养至OD590=0.8时，加入1 mmol/L的IPTG诱导表达，4 h后收集菌体。随后的蛋白纯化按照Qiagen公司Ni-NTA argrose使用说明进行操作。离心收集菌体沉淀，每1 g沉淀湿重加5 mL Buffer B(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 8.0) 重悬菌体，置于室温下振摇，超声破碎10 min, 12000 rmp离心15 min，收集上清。按1∶4比例，将50%Ni-NTA琼脂糖珠和菌体裂解液上清装入纯化柱，室温下置水平摇床振摇60 min混匀，过柱。用2倍柱床体积Buffer C(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 6.3)洗脱3次，用2倍柱床体积Buffer D(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 5.9)洗脱1次，再用用2倍柱床体积Buffer E(100 mM NaH2PO4，10 mM Tris·Cl，8 M urea，pH 4.5)洗脱His-CDV-N588融合蛋白，洗脱5次。分别收集少量菌体裂解液上清、沉淀、过柱液、Buffer C和Buffer E洗脱品进行SDS-PAGE分析。

1.7 His-CDV-N588融合蛋白Western blotting检测

分别收集少量非纯化菌体蛋白和纯化了的His-CDV-N588融合蛋白，进行SDS-PAGE，用湿转法将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，用TBST缓冲液漂洗10 min, 然后用TBST配制的3%BSA, 4℃封闭过夜。弃去封闭液，加入用封闭液稀释的His单克隆抗体(1∶500)室温孵育2 h, 然后4℃过夜。TBST洗膜3次，每次10 min, 加入HRP标记的山羊抗鼠IgG(1∶1500), 室温孵育2 h, TBST洗膜3次，每次10 min。加入化学发光剂A、B作用5 min, 在暗盒内压X光片(转印膜蛋白面朝上)，曝光、显影和定影。用预染蛋白marker判定目的蛋白的相对分子量。

2 结果

2.1 CDV-N截短体基因PCR扩增

CDV-N588PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，获得大小约为0.6 kb左右的片段，与预期长度一致(图1)。

2.2 pMD18T-CDV-N588重组质粒酶切鉴定和测序

重组质粒pMD18-T-CDV-N588经Bam HI和HindⅢ进行酶切鉴定，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶图上出现了约2.7 kb和0.6 kb的预期条带(图2)，表明该重组质粒为阳性。与GenBank上己公布的同名基因(登录号：HM596308.1)相比较，核苷酸序列(图3)和推导的氨基酸序列(图4)相似性为均为99%。

M: DNA marker DL 2000；

M1：DNA MarkerDL 2000；

图3 CDV-N截短体基因测序结果

图4 推导的CDV-N截短体基因氨基酸序列

2.3 CDV-N截短体基因原核表达载体构建

Bam HI 和Hind Ⅲ 双酶切原核表达质粒pET30a-CDV-N588，经1%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶图片上显示了约5.9 kb和0.6 kb预期条带(图5)，结果表明原核表达重组质粒构建成功。

2.4 重组质粒pET30a-CDV-N588在大肠杆菌中的诱导表达

将重组质粒pET30a-CDV-N588转化大肠杆菌BL21，经1 mmo/L 的 IPTG诱导表达和未诱导重组菌液进行SDS-PAGE凝胶电泳，结果显示IPTG诱导的重组菌液在相对分子量约30 KDa处有蛋白条带，而未诱导的重组菌液未出现此条带(图6)。

M：预染蛋白marker；1、3、5、7：未诱导的重组BL21；

2.5 His-CDV-N588融合蛋白纯化

应用Ni-NTA琼脂糖珠在变性条件下纯化的His-CDV-N588融合蛋白呈现单一条带(图7)，纯度高。纯化前后的蛋白样品经Western blotting检测，均呈现预期大小的蛋白条带(图8)，证明笔者确实获得了His-CDV-N588融合蛋白。

M：预染蛋白marker；1:未诱导的重组BL21;

M：预染蛋白marker；1:未诱导的重组BL21;

3 讨论

近些年CDV-N基因的克隆、原核或真核表达研究主要选用N蛋白基因全长片段。本实验截取CDV-N基因B细胞抗原表位较集中的一段用于原核表达，获得了高纯度的His-CDV-N截短体融合蛋白，该片段可能比全长CDV-N基因具有更好的免疫原性。

近些年，笔者所在实验室在原核表达、蛋白纯化和多克隆抗体制备方面做了大量工作，经过长时间探索，发现真核基因在原核细胞中多以包涵体形式表达，用8 mol/L(pH 8.0)溶解包涵体，变性条件下纯化His标签融合蛋白行之有效，纯化后的蛋白无需复性，就可以直接免疫兔或鼠制备多克隆或单克隆抗体。这些前期研究建立的技术平台为CDV-N截短体基因原核表达和蛋白纯化提供了有力的技术支持。

表达载体上的6×His标签序列与Ni离子具有很强的亲和力， His标签蛋白结合能牢固结合在Ni-NTA 琼脂糖珠介质上。纯化过程中，杂蛋白富含组氨酸区域会非特异性地与Ni-NTA琼脂糖珠介质结合从而影响纯化效率。但蛋白是两性分子，带电性质可随pH的变化而变化，当杂蛋白洗脱液pH值与目的蛋白等电点pH值相近时，杂蛋白被洗脱;降低pH，可以减弱His标签蛋白与Ni离子的结合力，从而能洗脱并得到较高纯度的目的蛋白。本研究中CDV-N588蛋白的等电点pH值为5.4，笔者将杂蛋白洗脱液pH值调至6.3(Buffer C)和5.9(Buffer D)，目的蛋白洗脱液(Buffer E)pH调至4.5，有效地解决了杂蛋白污染问题。在纯化过程中，细胞破碎条件和裂解液过柱速率也影响纯化效果。超声波破碎功率太高和工作时间太久会产生气泡影响破碎效果，功率太低和间隔时间太短则会破碎不完全。工作5 s，间隔10 s，360 W作用30 min，是超声波破碎最佳条件；细胞裂解液过柱速率不能太快，否则会导致目的蛋白CDV-N588与纯化介质结合率下降，最佳过柱速率为30滴/min。通过对纯化过程的优化，我们顺利得到了His-CDV-N588融合蛋白。

4 结论

采用PCR技术，成功扩增了CDV-N截短体基因片段， 成功构建了CDV-N截短体基因原核表达载体， pET30a-CDV-N588在大肠杆菌中得以高效表达，纯化后的His-CDV-N588蛋白纯度较高，可用于单克隆或多克隆或抗体的制备。

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