姜薇

【摘 要】为了脱除鹿托盘蛋白水解液中的盐分并分离出具有较高抗氧化活性的组分，本研究选择DA201-C大孔树脂对水解液中多肽的吸附能力进行测定。结果表明：当多肽浓度为10 mg/mL，上样流速1.0 BV/h，树脂对多肽的脱盐率达到98.64±2.45%，其中75%乙醇洗脱组分的抗氧化活性最高，此时鹿托盘多肽对DPPH·和ABTS·+的清除率分别为89.5±1.14%和86.3±1.47%

【关键词】鹿托盘；大孔吸附树脂；蛋白水解液；脱盐；分离纯化

中图分类号：TS251.92 文献标识码： A 文章编号： 2095-2457（2018）08-0045-002

Effect of Macroporous Adsorption Resin on Desalination and Purification of Deer Trays Protein Hydrolysate

JIANG Wei

（Huangshan College of Tourism， Huangshan， Anhui 245041， China）

【Abstract】In order to remove the salt from the hydrolysates of deer trays and isolate the components with higher antioxidant activity， the DA201-C macroporous resin was used to determine the adsorption capacity of polypeptides in the hydrolysate. The results showed that when the peptide concentration was 10 mg/mL and the sample flow rate was 1.0 BV/h， the desalination rate of the resin to the peptide reached 98.64±2.45%. Among them， the antioxidant activity of the 75% ethanol elution component was the highest. The clearance rates of DPPH· and ABTS·+ by peptides were 89.5±1.14% and 86.3±1.47%， respectively.

【Key words】Deer tray； Macroporous resin； Protein hydrolyzate； Desalting； Separation and purification

每年6月份为梅花鹿或马鹿的产鹿茸期，鹿茸被收割后会残留约3cm的根基，并于次年新鹿茸长出前脱落，因其形似一个圆盘，故名鹿托盘、鹿角冒[1]。鹿托盘中含有丰富的胶原蛋白，经碱性蛋白酶水解后可获得具有抗氧化活性的蛋白水解液，因在酶解的过程中需要不断的添加NaOH溶液来维持水解液pH的稳定性，从而导致水解中存在大量的盐分，盐分的存在会影响鹿托盘抗氧化肽的应用领域。

一般情况下，透析袋常被用来对大分子有机物进行透析除盐，但是实验过程要不断地更换缓冲溶液，具有耗时长、损失高、资源浪费等缺点。除此之外，还可以采用纳滤膜[2]、凝胶色谱法[3]对蛋白进行纯化，但它们都比较昂贵仅限于实验室研究。大孔树脂除盐具有低成本、高效并能保证产品活性的优点，已被广泛地用于生物样品的除盐[4]。大孔树脂对有机物的吸附作用，依靠于其与有机物疏水基团之间的范德华力，而无机盐不被大孔树脂吸附，采用去离子水就能将水解液中的盐分去除，通过添加合适的解析液就能改变吸附体系的疏水与亲水平衡，影响两者的吸附力大小，从而使具有不同疏水基团的有机物被解析下来[5]。

本文研究鹿托盘多肽浓度、上样流速对DA201-C大孔树脂吸附能力的影响，并用不同浓度乙醇溶液进行解析，旨在获得抗氧化活性较高的鹿托盘多肽组分，为鹿托盘多肽的深度开发利用提供一定的实验数据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

鹿托盘，中韩动物科学研究所提供；DA201-C大孔吸附树脂，勤实科技。

1.2 仪器设备

DDS-307型电导率仪，购于上海右一仪器有限公司；TU-1810型紫外可见分光光度计，购于北京普析通用仪器有限责任公司；BSZ-100型自定收集器，购于上海沪西分析仪器厂有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 预处理

取100g DA201-C大孔树脂用1L无水乙醇浸泡24 h，真空抽滤回收乙醇，再用无水乙醇洗涤大孔树脂树脂至在220nm紫外光区无吸收峰。处理过的大孔树脂用去离子水浸泡，并多次换水至大孔树脂无乙醇味。

1.3.2 静态吸附试验

准确称取1g經1.3.1处理过的树脂置于50mL具塞锥形瓶中，再加入10mL鹿托盘蛋白水解液，放入30℃恒温水浴振荡器中，振荡吸附4h，考察不同的多肽浓度（2.5、5、10、20、40mg/mL）对DA201-C大孔树脂吸附率的影响。水解液中蛋白质的初始浓度记为C0，吸附后的蛋白浓度记为C1，根据公式（1）计算大孔树脂的吸附率。

吸附率（%）= ×100%（1）

1.3.3 动态吸附与洗脱试验

将经1.3.1处理过大孔树脂慢慢装入φ1.5cm×50 cm的色谱柱中，用去离子水预冲洗至流出液在220 nm处无吸收峰，固定上样浓度10mg/mL、上样体积100mL，考察不同的上样流速（1.0、1.5、2.0 BV/H）对鹿托盘多肽的吸附效果。收集洗脱液5 mL/管，用电导率仪分析每管的离子浓度；用紫外分光光度计检测收集液在220nm处的吸光值，用以分析收集液中的蛋白质浓度的高低。然后分析不同乙醇溶液（0、25、50、75、100%）的洗脱组分的抗氧化活性。

1.3.5 检测方法

蛋白浓度的测定采用考马斯亮蓝法，按照文献[6]；清除 ABTS·+的测定方法按照文献[7]；DPPH·清除率检测方法按照文献[8]。

2 结果与分析

2.1 多肽浓度对大孔树脂吸附效果的影响

由图1可以看出，当鹿托盘多肽浓度小于10mg/mL时，DA201-C大孔吸附树脂对多肽的吸附率随多肽浓度的增加而增加。当多肽浓度超过10mg/mL时，吸附率随多肽浓度的增加反而下降。当样品浓度为10mg/mL时，大孔树脂对样品的吸附量达42.27±0.73mg/g，吸附率为84.55±1.45%。

2.2 上样速度对DA201-C大孔树脂吸附性能的影响

从图2可以看出，随着上样流速的提高，样品的流出量增加，即过高的流速降低了鹿托盘多肽与大孔树脂的接触时间。大孔树脂对有机物的吸附过程一般需要依次经历液膜扩散、颗粒内扩散，最后完成吸附反应三个阶段，有时三个阶段也可能同时进行。大孔树脂与有机物质的吸附反应是在一定的温度和时间内，有机物在溶剂和大孔树脂中的分配达到一定的动态平衡状态。如果上样流速过快，多肽溶液无法完成吸附反应的三个阶段，而不能被大孔树脂吸附就随着溶液流出[5]。因此，我们选取上样流速为1.0 BV/h。

2.3 乙醇浓度对DA201-C大孔树脂的吸附及脱盐分析

大孔树脂对鹿托盘多肽的吸附作用，依靠于其与多肽疏水基团之间微弱的范德华力，通过添加合适的解析液就能改变吸附体系的疏水与亲水平衡，从而使具有不同疏水基团的多肽被解析下来，由于水解液中的无机盐不具有疏水性，而随着溶液流出洗脱柱，从而与鹿托盘多肽分开[9]。乙醇具有安全无毒、沸点低、易回收、成本低等优点，是最常用的解析液，不同浓度的乙醇能改变鹿托盘多肽与大孔树脂的吸附能力，多肽的疏水性越高需要解析的乙醇浓度就越高，而达到分离纯化的作用[10]。

由图3可以看出，鹿托盘蛋白水解液中的无机盐在用去离子水洗脱前基本就随着溶剂流出洗脱柱，脱盐效果较好，此时除盐率可达98.64±2.45%。由于鹿托盘蛋白主要以胶原蛋白为主，胶原蛋白经酶解后的多肽分子量相对较大，疏水性较大的多肽占有比例较少，因此，25%和50%浓度的乙醇洗脱出的多肽浓度较高。

2.4 不同组分多肽抗氧化活性分析

由图4可以看出，乙醇浓度75%的洗脱组分对DPPH·和ABTS·+的清除的能力最强，比25%乙醇洗脱组分的抗氧化活性有大幅度提高，此时75%的洗脱组分对DPPH·和ABTS·+的清除率分别为89.5±1.14%和86.3±1.47%

3 结论

本研究选择DA201-C大孔树脂对鹿托盘多肽进行脱盐和分离纯化，研究了多肽浓度和上样流速对大孔树脂吸附能力的影响。实验结果表明多肽浓度为10mg/mL，上样流速1.0BV/h时大孔树脂对鹿托盘多肽的吸附性能较好。抗氧化实验得出，75%乙醇洗脱组分多肽的抗氧化活性最高，此时多肽对DPPH·和ABTS·+的清除率分别为89.5±1.14%和86.3±1.47%。

【参考文献】

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[10]夏樹花，王璋，许时婴.采用大孔吸附树脂提纯螺蜘腹足几酶解产物的研究[J].食品与发酵工业，2006，32（2）：116-120.