杜香挥发油提取工艺研究及成分GC-MS分析

2018-06-07尤莉艳马朝红

江苏农业科学 2018年10期

尤莉艳，杨婷，姜辉，马朝红

(1.吉林农业科技学院长白山动植物利用与保护吉林省高校重点实验室，吉林吉林 132101； 2.吉林农业科技学院文理学院，吉林吉林 132101)

细叶杜香(LedumpalustreL. var.angustumE. Busch)，别称喇叭茶，是杜鹃花科杜香属常绿小灌木。我国野生杜香资源丰富，主要分布于我国大小兴安岭、内蒙古和长白山地区。文献报道杜香属植物含有丰富的挥发油、黄酮类和萜类等化合物[1-2]。杜香的枝、叶、花和果实均可提取出芳香挥发油，其中花、果出油率较高。杜香挥发油成分的功效已被运用于日常生活、医疗、香料生产等领域，如杜香挥发油可以扩张血管、降低血压、镇咳平喘、治疗胃溃疡和月经不调，同时在杀菌、祛除脚气和治疗皮肤瘙痒等方面也有显著的治疗效果[1-3]。

目前，提取天然产物的方法主要有水蒸汽蒸馏法、超声波提取法、超临界CO2萃取法等。超声波独具的极端物理特性及其产生的强烈振动可促使植物组织破壁或变形，使有效成份提取得更充分，可以提高细胞破碎度和有效成分的提取率。据文献报道，杜香花蕾中含挥发油15%～20%[4-5]，而目前生产上杜香挥发油的茎和叶提取率不高[6-7]，且关于提取工艺优化的研究较少。因此，本研究设计以杜香挥发油提取率为评价指标的正交试验，对杜香枝叶挥发油的提取工艺进行优选，并用气相色谱-质谱联用(gas chromatography-mass spectrometer，简称GC-MS)分析技术对提取的杜香挥发油进行了成分鉴定，以期为充分利用杜香资源提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 原材料采自黑龙江省塔河林业局，经吉林农业科技学院校内从事药用植物研究的孙仓教授鉴定为杜鹃花科杜香属植物细叶杜香。

1.1.2 主要试剂无水乙醇(A.R.)，由天津市大茂化学试剂厂生产。

1.1.3 主要仪器 GC-MS色谱仪(型号为QP2010 Ultra)，购自日本岛津公司；电子分析天平(型号为ME203E)，购自梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；数控超声波清洗器(型号为KQ-100DE)，购自昆山市超声仪器有限公司；数显恒温水浴锅(型号为HH-12)，购自上海况胜实业发展有限公司；电热恒温鼓风干燥箱(型号为DHG-9030)，购自上海一恒科学仪器有限公司；粉碎机(型号为HK200)，购自广州华凯机电设备有限公司；标准分样筛(型号为304)，购自浙江省绍兴市上虞区华丰五金仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 杜香挥发油的提取取用的材料为新鲜的杜香茎和叶，将杜香的茎用剪刀剪成3 cm左右装入烧杯中，然后反复用自来水清洗，直到洁净为止，再用蒸馏水清洗，置于60 ℃烘箱中烘干，然后用粉碎机粉碎，过80目筛。

杜香挥发油提取率=杜香挥发油质量/杜香粗粉质量×100%。

1.2.2 杜香挥发油提取的单因子试验

1.2.2.1 提取溶剂浓度的筛选精确称量研磨后的杜香粉末5 g，共5份，设定超声时间为15 min，超声功率为50 kHz，超声温度为60 ℃，料液比为1 g ∶15 mL，分别用30%、40%、50%、60%、70%乙醇提取杜香挥发油，通过比较挥发油的提取率，确定合适的乙醇浓度。

1.2.2.2 提取温度的筛选精确称量研磨后的杜香粉末 5 g，共5份，设定超声时间为15 min，超声功率为50 kHz，料液比为1 g ∶15 mL，乙醇浓度为50%，设定提取温度分别为30、45、60、75、90 ℃，通过比较挥发油的提取率，确定合适的提取温度。

1.2.2.3 料液比的筛选精确称量研磨后的杜香粉末5 g，共5份，设定超声功率为50 kHz，超声温度为60 ℃，超声时间为15 min，乙醇浓度为50%，将料液比分别设定为1 ∶10、1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30(g ∶mL)，通过比较挥发油的提取率，确定合适的料液比。

1.2.2.4 提取时间的筛选精确称量研磨后的杜香粉末 5 g，共5份，设定超声功率为50 kHz，超声温度为60 ℃，料液比为1 g ∶15 mL，乙醇浓度为50%，分别超声提取5、10、15、20、25 min，通过比较挥发油的提取率，确定合适的超声时间。

1.2.3 杜香挥发油提取的正交试验选取乙醇浓度、超声温度、料液比、超声时间等4个因素，每个因素3个水平，采用L9(34)表进行正交试验，对超声提取杜香挥发油的条件进行优化。L9(34)正交试验的因素与水平设计见表1。

表1 L9(34)正交试验因素与水平

1.2.4 杜香挥发油的成分分析采用气相色谱-质谱联用技术对超声波法提取的杜香挥发油成分进行分析。

1.2.4.1 气相色谱条件色谱柱型号为Rxi-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度为300 ℃；载气为高纯氦(99. 999%)；柱流速为1 mL/min；程序升温，初始温度为 60 ℃，保持5 min，然后以5 ℃/min的速度升至 300 ℃，保持5 min；进样模式为分流进样，分流比为100 ∶1。

1.2.4.2 质谱条件离子源为电子轰击(EI)源，离子源温度为230 ℃，传输线温度为300 ℃；扫描范围为35～500m/z。利用NIST11.LIB标准质谱库计算机联机检索，结合有关文献进行分析。

2 结果与分析

2.1 杜香挥发油提取的单因素试验

2.1.1 乙醇浓度对杜香挥发油提取率的影响由图1可知，乙醇浓度从30%增大到70%，杜香挥发油提取率随着乙醇浓度的增大呈先增加后减小的趋势。其中，乙醇浓度从30%增大到40%时，提取率上升趋势明显，乙醇浓度从40%增大到50%，提取率变化不明显。乙醇浓度从50%增大至70%，提取率明显下降。由于乙醇浓度的增大会使一些醇溶性色素、亲脂性强的成分及杂质的溶出量增加，且溶剂浓度增加可引起提取成本增加，因此选用浓度40%、50%、60%的乙醇进行正交试验。

2.1.2 提取温度对杜香挥发油提取率的影响由图2可知，温度较低时，杜香挥发油提取率较低，其原因可能是低温不利于超声波的空化作用。提取温度从30 ℃升高到75 ℃，杜香挥发油的提取率呈明显上升趋势，且当提取温度为75 ℃时，提取率达到最大值。超声温度从75 ℃升高到90 ℃，杜香挥发油提取率随着温度的升高明显降低，其原因可能是高温条件下杜香挥发油的稳定性差，杜香挥发油发生分解，导致提取率降低。因此，选用45、60、75 ℃的超声温度进行正交试验。

2.1.3 料液比对杜香挥发油提取率的影响由图3可知，杜香的提取率随着料液比的增大而增加，所以料液比的增大有利于杜香挥发油提取率的提高。当料液比达到1 g ∶30 mL时，提取率达到最大值。料液比从1 g ∶25 mL增大到 1 g ∶30 mL，杜香挥发油提取率的增加趋势不明显，考虑到节约溶剂，避免不必要的浪费和污染，选用1 ∶15、1 ∶20、1 ∶25(g ∶mL)的料液比进行正交试验。

2.1.4 提取时间对杜香挥发油提取率的影响由图4可知，超声时间从5 min延长到25 min，提取率提高，且当超声时间为25 min时，提取率最高，说明适当延长提取时间，有利于杜香挥发油的溶出，进而提高提取率。考虑到超声时间为15～25 min时，提取率无明显差异，因此为节约时间和能源，缩短提取周期，选择10、15、20 min的超声时间进行正交试验。

2.2 杜香挥发油提取的正交试验

由表2可知，各因素对杜香提取率的影响程度表现为乙醇浓度>提取温度>提取时间>料液比，其中乙醇浓度为主要因素，提取温度和提取时间次之，料液比的影响最小，根据正交试验结果和极差分析最佳提取工艺，二者最佳工艺条件不吻合，所以，将正交试验条件(A2B3C1D2)和极差分析条件(A2B3C3D2)进行比较，结果见表3，按照极差分析得到的工艺条件的提取率均高于按照正交试验的最高提取率。因此，超声提取杜香挥发油的最佳工艺条件为A2B3C3D2，即乙醇浓度50%，提取温度75 ℃，料液比1 g ∶25 mL，超声时间 15 min。此外，为验证最佳工艺条件，在A2B3C3D2条件下进行验证试验，杜香挥发油的平均提取率为8.49%。

表2 杜香挥发油提取正交试验结果与分析

表3 杜香挥发油提取验证试验结果

注：RSD表示相对平均偏差。

2.3 杜香挥发油的成分分析

对杜香挥发油提取物进行GC-MS分析，由图5可知，由超声提取法得到50多个峰，从中鉴定出27种化合物，占总峰面积的72.70%，所鉴定的化合物相似度均≥90%，对于相似度较低或者检索结果不符合出峰及质谱断裂规律的物质，未进行分析和讨论。鉴定出的杜香挥发油主要成分及其相对含量见表4。结果表明，杜香挥发油的主要成分有萜类、芳香烃、烯烃、醇、酮和酯类化合物，其中含量较高的化合物有桃金娘烯醛、甲基异丙基苯、4-萜烯醇、枯茗醛、枯茗醇、β-水芹烯、γ-松油烯等。

3 结论

在超声波法提取杜香挥发油的试验中，选用溶剂浓度、提取温度、料液比和提取时间作为考察因素进行正交试验。结果表明，影响杜香挥发油提取率的主要因素为溶剂浓度，其次是提取温度和提取时间，料液比影响最小。确定最佳提取工艺条件为A2B3C3D2，即乙醇浓度50%，提取温度75 ℃，料液比1 g ∶25 mL，提取时间15 min，经试验证明，利用此方法提取杜香挥发油的平均提取率可达到8.49%。此外，通过 GC-MS 分析杜香挥发油的成分发现，其主要成分为萜类、芳香烃、烯烃、醇、酮和酯类化合物等，其中含量较高的化合物有桃金娘烯醛、甲基异丙基苯、4-萜烯醇、枯茗醛、枯茗醇、β-水芹烯、γ-松油烯等。