陈铁柱， 文飞燕， 夏燕莉， 杨玉霞， 方清茂， 张 浩， 薛 丹

(1.四川省中医药科学院，四川成都 610041； 2.四川大学华西药学院，四川成都 610041)

七叶一枝花[ParispolyphyllaSmith var.chinensis(Franch.) Hara]是2015年版《中国药典》收载的重楼药材的2种基原植物之一[1]，别称华重楼，属二级濒危物种。其根状茎入药，是传统的中藏彝傣医药体系常用的大宗药材，具有清热解毒、消肿止痛、凉肝定惊之功效，为云南白药系列产品、沈阳红药系列、季德胜蛇药片等20多个国家重点保护重要的主要原料药。其供需矛盾尖锐、市场缺口巨大，导致野生资源遭遇掠夺式采挖，致使许多未达入药年限的药材资源被仓促采挖，药材质量下降。再者，七叶一枝花的人工规模化种植业尚未形成规模[2-4]，种源多来自野生混杂群体，在全国多数地区为从当地山上野生直接采挖移栽，由于野生生长年限不一，难以对栽培效果进行评价，种苗的混乱不堪更加剧了药材质量的参差不齐。

对于多年生重楼来讲，其药材质量受品种、产地和采收年限等多种因素的影响，已有研究证实随生长年限的增加，滇重楼地下根茎中甾体皂苷的含量呈现总体升高的趋势[5-7]。而对七叶一枝花植株性状、根系发育、产量及皂苷成分含量动态研究尚不清楚，因此合理的采收年限尚不能确定。四川的龙门山脉地区是七叶一枝花的主产区，笔者在该地区构建了七叶一枝花种质资源圃，进行了摸索性试验研究。用种子繁育出大量的实生苗，已经连续进行了8年，得到了1～8年生的七叶一枝花植株和材料。本试验研究用种子繁殖的七叶一枝花的植株、根系、产量和皂苷含量与其生长年限的关系，明确七叶一枝花生长趋势曲线，探明皂苷类化学成分含量是否受到生长年限的影响，探索七叶一枝花最适宜的采收年限，为七叶一枝花规范化栽培的次生代谢调控与采收年限的确定提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材来源 在四川省彭州市七叶一枝花种植基地于2007—2014年连续8年进行七叶一枝花实生苗的试验研究，实生苗经四川大学生药教研室张浩教授鉴定为七叶一枝花。基地海拔高度1 020 m，位于103.930°E、30.980°N，土壤为黑壤土。栽培过程中进行常规的田间管理。

1.1.2 仪器与试剂 岛津LG-10A高效液相色谱仪，DAD检测器；D1810D自动纯水蒸馏器。乙腈和甲醇均为色谱纯，水为双蒸水。重楼皂苷Ⅰ(111590-200402)、重楼皂苷Ⅱ(111591-200402)均购于中国药品生物制品检定所；重楼皂苷Ⅶ、偏诺皂苷-3-O-β-D-葡萄糖(1→3)[α-L-鼠李糖(1→2)]-β-D-葡萄糖(PGGR)、重楼皂苷H、重楼皂苷Ⅵ、纤细薯蓣苷和重楼皂苷Ⅴ这6个对照品都由笔者所在课题组提取分离所得，纯度超过98%。

1.2 方法

1.2.1 植株形态、根系、单株产量数量性状的测定 于2014年10月中旬七叶一枝花地上部分停止生长后，在试验基地定株测定植株的株高、茎粗、叶片数、叶片长和叶片宽；同时采集地下根茎，其中1年生七叶一枝花植株60株，2～8年生长年限植株各30株，测定主根长、根茎直径、须根数、须根长、须根宽、鲜质量、干质量等数量性状。

1.2.2 药材中皂苷类成分的测定 采集到的药材低温干燥后打粉过筛(40目)，应用HPLC法进行皂苷类成分的测定。色谱条件的确立、对照品和供试品溶液的制备、线性关系的考察、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收试验、样品测定的具体方法见陈铁柱等介绍的方法[8]。药材留样凭证标本存放于四川省中医药科学院标本室，所有样品均有原植物数码照片及原植物标本。

1.2.3 数据分析 方差分析使用SPSS 22.0数据处理软件。

2 结果与分析

2.1 生长年限对七叶一枝花植株性状的影响

不同生长年限七叶一枝花的株高、茎粗、叶片数、叶片长、叶片宽有显著差异(图1)。随着年限的增长，株高不断增加；1～5年生的茎粗增粗明显，随后的3年增粗不明显；叶片数随着年限不断增加，8年生叶片数平均达12.5张；叶片长也在不断增长，其中1～4年生的叶片长增长明显；叶片宽在 1～5年生间增宽明显，随后3年增宽不明显。

2.2 不同生长年限七叶一枝花的根系性状分析

不同生长年限七叶一枝花根系数据呈显著差异(图2)。随着年限的增长，主根长逐渐增长，其中1年生和2年生、3年生和4年生、5年生和6年生、7年生和8年生的主根长差异均不显著，但是每相隔2年其主根长差异均显著；主根直径随着年限的增长不断增大，但5～8年的主根直径增大差异不显著；须根数逐渐增多，其中2年生与3年生、5年生和6年生、7年生和8年生的须根数差异不显著；1～3年生的须根长和须根直径差异不显著，须根直径从4年生开始每相邻的2年之间差异不显著(6～7年生除外)。

2.3 不同生长年限七叶一枝花的单株产量分析

不同生长年限七叶一枝花的鲜质量、干质量、折干率、增质量倍数均差异显著(图3)。1年生和2年生、3年生和4年生、6～8年生的鲜质量差异不显著，随着年限的增长，根茎鲜质量在不断增加。1～3年生的干质量差异显著，3年生和4年生、6～8年生的干质量差异均不显著，根茎干质量不断累积增长。1～3年生的折干率差异显著，随后的5年折干率差异均不显著。5年生的年增质量倍数要显著高于其他年生的增质量倍数，达到7.1倍左右。

2.4 不同生长年限七叶一枝花皂苷含量分析

不同年限的七叶一枝花药材中的皂苷含量的测定结果见表1。1～8年生的七叶一枝花药材中均没有检测到重楼皂苷Ⅰ；1～7年生七叶一枝花中均没有检测到皂苷Ⅱ、纤细薯蓣皂苷和重楼皂苷V，尽管8年生药材中检测到皂苷H、纤细薯蓣皂苷和重楼皂苷V，但含量甚微。从不同生长年限药材中的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总量和重楼总皂苷含量变化曲线(图4)可以看出，1～5年生的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总量和重楼总皂苷含量呈现逐年下降的趋势；5～8年生的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总量和重楼总皂苷含量逐年上升。

3 讨论与结论

3.1 不同生长年限的七叶一枝花植株性状、根系性状、单株产量分析

七叶一枝花作为历版《中国药典》收载的法定品种，但研究相对较少，前人研究基础薄弱。七叶一枝花是多年生植物，植株生长缓慢，生长年限较长，研究周期也比较长[9-10]。同时七叶一枝花种子具有生理后熟和形态后熟的特征，自然条件下至少2年后才能发芽，而且出苗后当年幼苗会长出主根和萌发的芽鞘，叶片也只有1张，要用于大田栽培至少要等到出苗后2～3年，可见育苗周期长。因此，现有关七叶一枝花的实生苗的相关报道非常有限。本试验对用种子繁殖的1～8年不同生长年限的七叶一枝花植株进行了研究，得到了1～8年的生长变化曲线。结果显示，随着年限的增长，七叶一枝花植株性状、根系性状、单株产量数据呈逐渐增长的趋势。其中，5年生的七叶一枝花单株质量增质量倍数要显著高于其他年生，达到7.1倍左右，说明种植后5年是七叶一枝花快速生长期。

但6、7、8年生之间的茎粗、叶片宽、主根直径、须根数和须根长之间的差异不显著，尤其是7年生和8年生植株的株高、茎粗、叶片数、叶片长、叶片宽、主根长、根茎直径、须根数、须根长、须根宽、鲜质量、干质量没有显著差异。说明从种植后6年开始，七叶一枝花植株生长开始放缓，尤其在7年生和8年生表现得更为明显， 其8年生七叶一枝花平均每株干质量达到23.1 g，其质量与中药材市场上流通的中小规格的重楼质量相近。因此，用种子繁殖的实生苗，可在种植6年后进行采收。同时，建议继续深度开展七叶一枝花根茎种苗繁育及栽培技术研究，进行更长生长年限的研究，确定其更完善的技术体系，从而保障七叶一枝花栽培的技术的成熟度，实现规范化栽培。

表1 不同生长年限对七叶一枝花8种重楼皂苷含量的影响

3.2 不同生长年限的七叶一枝花药材中的皂苷种类和含量分析

生长年限为影响七叶一枝花药材质量的重要因素之一，搞清楚七叶一枝花化学成分含量随年限的变化规律，对其合理采收种植有很大意义。本研究连续测定了1～8年生的七叶一枝花药材中的皂苷类成分含量，结果发现，不同生长年限的七叶一枝花中重楼皂苷主要以偏诺皂苷为主，几乎没有检测到薯蓣皂苷成分重楼皂苷Ⅱ、纤细薯蓣皂苷、重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅴ。整体上看，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总量和重楼总皂苷含量呈现一个大致“V”字形的变化趋势，即1～5年生重楼皂苷含量逐年下降，可能由于这5年属于七叶一枝花的快速生长期(从单株根茎干质量的增质量比率也可以看出是快速增长期)，随年限的增长，体内积累淀粉等物质呈倍数显著增长，从而导致其皂苷含量逐渐降低；从种植后5年开始，根茎干质量增质量倍数降低，体内淀粉等物质含量增速放缓，从而导致其皂苷含量逐渐升高。

七叶一枝花的皂苷类成分含量随生长年限的变化而变化，大部分皂苷类含量并不是随着生长年限的增长而不断增加，6年生的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的总量和重楼皂苷总含量反而不如4年生，从这个角度看4年生七叶一枝花质量较6年生更好。所以，从质量角度来讲，并不是生长年限越长越好。所有生长年限的药材样品中，均检测到重楼皂苷Ⅶ和重楼皂苷H，作为《中国药典》考察的成分指标重楼皂苷Ⅶ，其含量从种植后1年一直连续下降到种植后4年，从种植后5年开始连续上升到种植后8年，种植8年之后是否还会继续上升有待于进一步研究。

参考文献：

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