鲁海菊， 江 涛， 胡金碧， 毛春诚， 王传铭

(红河学院生命科学与技术学院，云南蒙自 661199)

自1998年台湾地区首次报道枇杷根腐病以来，福建、云南等地区也相继发生枇杷根腐病，其田间症状初期表现出树势衰退，叶片变黄脱落，下大雨时，植株发病较快，只留下褐色干枯的叶片挂在死树枝上，茎基部皮层变暗色，流胶。发病中期茎呈暗褐色，基部腐烂，韧皮部呈鱼鳞状，地上部维管组织呈红褐色。病株根环腐，不长新根，有白色菌丝。后期植株萎蔫、树皮脱落、最后整株枯死。云南、台湾、福建等3个枇杷栽培区，其根腐病症状相似，但病原菌各不相同，分别由小孢拟盘多毛孢(Pestalotiopsismicrospora)[1]、寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)[2]、帚梗柱孢属(Cylindrocladiumsp.)真菌[3]引起。经多次分离，云南地区未发现寄生疫霉和帚梗柱孢属真菌2种病原菌侵染枇杷引起根腐病的情况。枇杷根腐病属于土传病害，高温高湿有利于此病发生，发病高峰期在7、8月份，从出现症状到整株死亡，快的需要1个月，慢的也不超过2年，发病率高达40%及以上，且有逐渐加重之势，每年损失数亿元。云南地区的枇杷特色产业正面临着毁灭性灾难，急需高效的防治方法。

近年来，当地植保工作者联合红河学院积极探索防治枇杷根腐病的方法，但效果甚微。目前，除了氟菌·霜霉威(银法利)对枇杷根腐病有一定的控制效果之外，其他农药都没有控制效果。另外，由于此病发展迅速，往往来不及防治，植株就已死亡；加之氟菌·霜霉威价格较高(净含量为25 mL的1袋银法利市场售价为100元)，没有得到有效推广应用。可见，化学防治未能有效控制枇杷根腐病。另外，化学防治土传病害存在施药困难、成本高、容易引起残留及环境污染等问题。枇杷抗病育种工作目前相对滞后，在枇杷中寻找抗枇杷根腐病的基因，成功培育出抗枇杷根腐病的抗性品种，在短期内难以实现。目前看来，生物防治是一种经济有效的控制枇杷根腐病的方法。

鲁海菊等报道，内生木霉P3.9菌株对枇杷根腐病病菌(P.microspora)有强烈的抑制作用[4]，抗菌谱广[5]，对枇杷内生真菌[6]及其根际土壤真菌[7]均有极强的抑制作用。P3.9菌株能成功定殖于枇杷主干及其根际土壤中，盆栽防治效果高达80%，且具有固氮、抗化学农药、降解难溶磷酸盐、降解纤维素等多种功能(未发表)，具有广阔的开发应用前景。虽然目前木霉P3.9菌株是防治枇杷根腐病良好的菌种资源，但也存在菌种衰退的风险。因此，笔者从黄瓜及枇杷中分离得到12株内生木霉，拟测定其对枇杷根腐病病菌的抑制作用，筛选出更多能防治枇杷根腐病的优良木霉菌株，以期为此病害的绿色防控提供菌种资源及理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试菌株 12株内生木霉(Trichodermaspp.)菌株，分别分离自黄瓜的茎(菌株J1、J2、J3、J4、J5、JD3)、根(菌株GD3、GD5、GM6)、叶(菌株Y2)及枇杷主干韧皮部(菌株PZ1、P3.9)。枇杷根腐病病菌(P.microspora)，分离自枇杷根腐病病株根茎韧皮部。

1.1.2 供试培养基 PDA培养基：200.0 g马铃薯、18.0 g葡萄糖、13.5 g琼脂、1 000 mL蒸馏水。PD培养基：200 g马铃薯、18 g葡萄糖、1 000 mL蒸馏水。将上述培养基配好后均在121 ℃高压灭菌30 min。材料均购自云南省蒙自市农贸中心及云南科仪化玻有限公司，试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 对峙培养 将枇杷根腐病病菌和各供试木霉菌株在PDA平板培养基中，于28 ℃恒温培养5 d，采用对峙培养法[8]，在培养基同一半径周围，用打孔器取直径为5 mm的菌饼，将木霉与病菌两两组合，同时接种于无菌PDA平板(直径 90 mm)中，2个接种点相距45 mm，以不接种木霉菌作为对照，设3次重复，在28 ℃恒温培养，第7天测定病菌的菌落直径，计算其生长抑制率。抑制率=[(dCK-dB)/dCK]×100%，其中dCK表示对照菌落直径，dB表示处理菌落直径。

1.2.2 拮抗等级测定 拮抗等级分级标准参照张瑾等的分级标准，Ⅰ：木霉菌菌落占据培养皿面积的100%；Ⅱ：3/4<木霉菌菌落占据培养皿面积<100%；Ⅲ：2/3<木霉菌菌落占据培养皿面积≤3/4；Ⅳ：木霉菌菌落占据培养皿面积≤2/3[9]。

1.2.3 木霉P3.9菌株液体培养 将木霉菌株接种在PDA培养基平板中，于28 ℃恒温扩大培养3 d，用灭菌蒸馏水冲洗孢子，制成孢子悬浮液(1.5×106个/mL)备用[10]，分别在 500 mL 锥形瓶中装入250 mL PD发酵培养液，同时接种2 mL孢子悬浮液，于28 ℃、180 r/min 摇床中培养7 d。然后真空抽滤菌丝体，制成滤液备用。

1.2.4 木霉P3.9菌株次生代谢产物对枇杷根腐病病菌的抑制作用测定 把“1.2.3”节中获得的木霉发酵滤液，在121 ℃高压蒸汽灭菌30 min，待冷却至45～50 ℃时，按照25%、50%、75%的比例加入已灭菌的PDA培养基中倒平板。另一处理将上述滤液在50 ℃水浴2 h，按照前述比例加入PDA培养基中倒平板。打取直径为5 mm的枇杷根腐病病菌菌饼，分别接种于上述准备好的2种平板中央，以不加木霉发酵液的PDA平板接种病菌菌饼作为对照。每个处理设3个重复。第7天测量菌落直径。

1.2.5 木霉P3.9菌株挥发性物质对枇杷根腐病病菌的抑制作用测定 将枇杷根腐病病菌和木霉菌株在PDA平板培养基中，28 ℃恒温扩大培养3 d，打取直径为5 mm的枇杷根腐病病菌菌饼分别接种于PDA平板中央，两培养皿对口，用胶带封口固定。以只接病菌的PDA平板作对照。每个处理设3个重复。第7天测量菌落直径。

1.3 数据统计

所有试验数据均采用SPSS 19.0统计软件Duncan’s多重比较法进行统计分析，计算各处理之间的差异性。

2 结果与分析

2.1 木霉菌株对枇杷根腐病病菌的抑制作用

由表1可知，12株内生木霉对枇杷根腐病病菌的抑制率均大于50%，具有较强的抑菌作用。相比较而言，P3.9、JD3菌株的抑菌率与其他菌株的抑菌率差异极显著(P<0.01)，抑菌率较高，分别达到80.1%、78.1%。说明这2个菌株的生防潜力最大。P3.9菌株分离自枇杷主干韧皮部，理论上更容易定殖于枇杷根际及其植株中，生防潜力较大。

表1 木霉菌株对枇杷根腐病病菌的抑制作用

注：数据后不同小写、大写字母分别表示在0.05、0.01水平上差异显著。表3同。

2.2 木霉菌株对枇杷根腐病病菌的拮抗等级

由表2可知，12株内生木霉对枇杷根腐病病菌均有拮抗作用。其中，菌株P3.9、JD3的拮抗等级为Ⅱ，菌株Y2的拮抗等级为Ⅳ，其余菌株的拮抗等级均为Ⅲ。由图1可知，J1、J3、J5、JD3、GD3、GD5、PZ1、P3.9等8个菌株菌丝覆盖病菌的同时，其上产生木霉分生孢子，J1、JD3、GD3、GD5等4个菌株产生的孢子量相对较多；GM6、Y2菌株不产生分生孢子。

2.3 木霉P3.9菌株次生代谢产物对枇杷根腐病病菌的抑制作用

由表3可知，内生木霉P3.9菌株发酵滤液在50 ℃水浴2 h，低浓度发酵液(25%、50%)对枇杷根腐病病菌几乎没有抑制作用，抑菌率均小于2%，高浓度发酵液(75%)对病菌有较强的抑制作用，抑菌率达78.9%，且病菌周围长满木霉分生孢子(图2)。内生木霉P3.9菌株发酵滤液经121 ℃高压蒸汽灭菌，高、低浓度均对枇杷根腐病病菌几乎没有抑制作用，抑菌率均小于5%。说明P3.9菌株次生代谢产物遇高温失活，丧失对枇杷根腐病病菌的抑制作用(图3)。

2.4 木霉P3.9菌株挥发性物质对枇杷根腐病病菌的抑制作用

枇杷根腐病病菌和木霉P3.9菌株在28 ℃恒温对扣培养7 d，对照病菌菌落直径为88.0 mm，处理病菌菌落直径为 62.3 mm，抑菌率为29.2%。说明P3.9菌株的挥发性物质对枇杷根腐病病菌的抑制作用很小(图4)。

3 结论与讨论

12株内生木霉对枇杷根腐病病菌均有较强的抑制作用，抑菌率均大于50%。其中，P3.9菌株的抑菌率最高，达 80.1%，其次为JD3菌株，其抑菌率为78.1%。P3.9菌株对枇杷根腐病病菌除了空间及营养竞争、重寄生之外，适当浓度的液体发酵滤液对病原菌的抑制作用也较强。说明木霉 P3.9 菌株能产生抑制枇杷根腐病病菌的次生代谢产物，其挥发性次生代谢产物也具有一定的抑菌作用。JD3菌株产孢能力比P3.9菌株强，其他生物学特性是否也强于P3.9菌株，还有待进一步研究。P3.9、JD3菌株对枇杷根腐病病菌的拮抗等级均为Ⅱ，Y2菌株的拮抗等级为Ⅳ，其余菌株的拮抗等级均为Ⅲ，有潜在的开发利用价值。可以考虑开发复合木霉菌剂，或与化学农药混配，以提高防病效果。

表2 木霉菌株对枇杷根腐病病菌的拮抗等级

我国化肥和农药过量施用现象严重，因此引起环境污染和农产品质量安全等重大问题，农作物绿色防控的呼声越来越高。木霉是目前在微生物生防资源中重要的物种之一，自2013年以来，我国已用木霉菌剂成功防治玉米小斑病[11]、黄瓜根结线虫病[12-13]、柑橘绿霉病[14]、黄瓜枯萎病[15]、茄子黄萎病[16]、人参锈腐病[17]、草莓根腐病[18]、草坪枯萎病[19]、水稻纹枯病[20]、向日葵菌核病[21]、茉莉白绢病[22]、香蕉枯萎病[23]、葡萄灰霉病[24]等多种作物病害。木霉P3.9菌株抗菌谱广[5]，有望防治枇杷根腐病、石榴枯萎病和干腐病、菊花根腐病和叶斑病、辣椒黄萎病等。其在作物根际土壤及植株中的定殖规律，对土壤微生物数量的影响及防病效果影响因素，有待进一步研究。

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表3 木霉P3.9菌株次生代谢产物对枇杷根腐病病菌的抑制作用

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