焦 展， 安胜军， 邵铁梅， 李 雪， 刘 培

(1.河北化工医药职业技术学院/河北省高校生物反应器与蛋白类药物开发应用技术研发中心，河北石家庄 050026；2.河北中医学院，河北石家庄 050091)

油用向日葵(HelianthusannuusL.)别称油葵，是重要的油料作物之一。向日葵基因转化研究中较成功的方法多是以离体培养为基础的农杆菌介导法，外植体包括茎尖、成熟胚子叶、下胚轴、未成熟胚、原生质体等[1-7]；而关于油葵的转化研究相对很少[8]。另外，受基因型限制，再生率低、抗性愈伤分化率低、生根难导致获得完整转化植株困难，基因枪转化稳定整合率较低，且极易发生早花——这些离体培养中的问题严重限制了向日葵尤其是油葵的遗传转化研究进程。因此，本试验借助GUS组织化学染色，分别对油葵的去1张子叶转化法和温室子叶节转化法、花粉管通道柱头滴加转化方法和子房注射转化方法进行比较研究，验证了简便易行且效率较高的油葵转基因方法。同时，这些转化方法最低限度涉及或者完全不涉及离体培养，避免发生离体早花现象，能够获得完整的转化植株。本研究为优化油葵转基因体系提供技术参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

以罗马尼亚油葵“精选”恢复系为试材，由河北省半干旱研究中心河北华丰种业惠赠。GUS基因转化试验所用双元表达载体为pBI121：：GUS，根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株为LBA4404，均由本实验室保存；含胰岛素基因的植物表达载体pBINOI由本实验室构建并保存[9]。

1.2 方法

1.2.1 农杆菌悬菌液的制备 接种农杆菌单菌落于液体YEB(5 mL)中。200 r/min、28 ℃振荡培养过夜，再次接种于100 mL液体YEB中(接种比例1 ∶100)，继续振荡8～16 h。离心(4 000 r/min、4 ℃、10 min)收集菌体，用pH值7.0的MS液体(含100 μmol/L乙酰丁香酮)重悬，备用。

1.2.2 去1张子叶转化法 挑选饱满的油葵种子约150粒，用无菌水浸泡过夜。在超净台上去壳后放入无菌瓶，用75%乙醇消毒50 s，后用5% NaClO消毒9 min，无菌水冲洗4～5次，每次1 min，最后加入1/2MS液体。封好瓶口放于摇床，130 r/min、27 ℃振荡培养一定时间。振荡培养时间设6个处理，即0、6、12、24、36、48 h，重复3次。

用无菌手术刀在萌发种子的子叶节部位斜切，并在解剖镜下去掉2张已萌发的幼叶和可见的叶原基，露出生长点部位(可借助解剖镜保证去除隐藏的幼叶)，并用注射器针头刺伤该区域，将该部分作为外植体备用。

侵染和培养方法参照RAO的方法[10]并加以改进。用含GUS基因的LBA4404农杆菌悬菌液浸泡侵染外植体30 min，随后用无菌滤纸吸干水分，放置于1/2MS固体培养基，共培养3 d。

1.2.3 温室子叶节转化法(别称温室茎尖转化法) 温室苗床播种油葵种子，待幼苗萌发后，2张子叶微张至约60°角时，用手术刀片于子叶节部位斜切去除1张子叶，或从2张子叶中间生长点部位纵切，使生长点裸露，并用注射器针头刺伤(可借助解剖镜保证去除隐藏的幼叶)。将制备好的悬菌液用注射器注入生长点部位，并用脱脂棉沾湿菌液覆于生长点部位3 d，保持黑暗并每天喷水保湿。3 d后摘掉无菌棉，光周期16 h/8 h培养至长出2～3张新的完整叶片。由于操作部位为子叶节区域，而侵染部位位于茎尖附近，因此本研究中温室子叶节转化法别称温室茎尖转化法。

1.2.4 质粒提取方法 质粒的提取方法参照文献[11]。导入液终浓度约为100 ng/μL，-20 ℃保存。操作时质粒须冰浴保存。

1.2.5 花粉管通道柱头滴加转化法 对管状花进行人工授粉，1～9 h后剪掉萎蔫的柱头，用微量进样器将质粒DNA溶液滴加到花柱上，每次5 μL，滴加3次。操作完成后用保鲜袋保湿2 h，随花盘开放每天由外而内操作，直至最内层的管状花开放完毕。授粉后减掉柱头的时间设1、3、5、7、9 h等5个处理，种子收获后统计结实率(结实率=结实小花数/操作小花数×100%)，后代经PCR检测统计植株阳性率(植株PCR阳性率=PCR阳性植株数/该代植株总数×100%)。

1.2.6 花粉管通道子房注射转化法 在人工授粉24～36 h后，撕开花冠和花丝筒，使子房暴露，针刺子房顶部正中部位，将25 μL微量进样器伸入子房，注射DNA溶液10 μL，重复3次。其他方面(保湿、操作顺序、结实率和阳性率)同柱头滴加法。

1.2.7 GUS基因表达的组织化学染色分析 利用pBI121：：GUS质粒进行花粉管通道转化，3 d后进行GUS组织染色，并观察幼胚染色情况。28 d后进行后代种子染色，观察种子染色情况。同时，设阴性对照(非转化的同步材料)，观察染色(染色方法及配方参照Jefferson的方法[12])情况。

1.2.8 转胰岛素基因油葵的PCR检测 方法比较完成后，使用含有胰岛素基因的LBA4404农杆菌菌株(载体结构见参考文献[9])，再次侵染去1张子叶外植体，3 d后转入MS+70 mg/L卡那霉素+300 mg/L头孢噻肟钠进行筛选。15 d后将抗性植株(根保留较多的)移栽入蛭石，或者将抗性芽进行嫁接(砧木采用2周龄同品种油葵幼苗)，以得到完整抗性植株，取植株上部新长出的叶片提取基因组进行PCR检测。PCR阳性植株上收获种子，播种长出T1代植株取新鲜叶片进行基因组提取，并进行PCR检测。进行温室子叶节转化，转化后取植株上部新长出的叶片提取基因组，进行PCR检测收获阳性植株种子，播种长出T1代植株取新鲜叶片提取基因组，并进行PCR检测。提取含胰岛素的基因的质粒进行花粉管通道柱头滴加或子房注射转化。进行转化的植株(T0代)收获的种子播种长出新植株(T1代)，取T1代鲜嫩叶片提取基因组进行PCR检测，其引物为：上游5′-CGGGGTACCTCG TCTAAATTTCAGCCTATCGACG-3′，下游5′-CGAGCTCTTA GTTGCAGTAATTTTCTAG-3′。

1.2.9 数据统计与分析 数据用Excel 2010和分析软件DPS 7.05处理，显著水平0.05。

2 结果与分析

2.1 利用GUS组织染色比较去1张子叶和温室子叶节转化效率

由于去1张子叶转化法和温室子叶节转化法2种方法的转化原理和被侵染材料类似，首先比较这2种方法的转化效果。用含GUS基因的农杆菌转化去1张子叶实生株和子叶微张的温室幼苗(温室子叶节转化)。对转化后的材料进行GUS组织化学染色。参考文献[13]拟定3个级别：Ⅰ级，GUS染色程度深，着色位点在子叶节及茎尖周围，蓝色部分连成片状，面积超过分生区的2/3；Ⅱ级，GUS染色程度一般，在茎尖区域及其周围有许多蓝色着色位点；Ⅲ级，GUS染色程度很浅，仅个别部位有零星蓝色斑点(图1)。2种方法各选用100个幼苗作为侵染材料(重复3次)，侵染后3 d对侵染材料进行GUS组织化学染色。分别统计处于各染色级别的外植体的数目，各级别GUS瞬时表达率=相应级别的GUS瞬时表达着色材料数/侵染材料总数×100%；总GUS瞬时表达率=GUS瞬时表达着色材料总数/侵染材料总数×100%。结果表明，通过去1张子叶侵染方法得到的转化材料明显多于通过温室子叶节转化方法得到的材料。去1张子叶侵染方法得到的GUS瞬时表达效率可达41.20%，而后者仅为13.36%(表1)。图2为去1张子叶转化法得到的GUS染色阳性植株(3 d)。因此，在后序研究中多采用农杆菌介导的去1张子叶转化方法进行侵染，并作为转化胰岛素基因的主要方法之一。

2.2 利用GUS组织染色比较柱头滴加法和子房注射法的转化效率

利用pBI121：：GUS质粒进行花粉管通道法转化。同上，利用组织化学染色的方法对2种方法的GUS基因的3 d后瞬时表达效率进行比较，拟定3个级别：Ⅰ级，GUS染色程度深，整个幼胚都着色；Ⅱ级，GUS染色程度一般，着色部位约占幼胚1/2；Ⅲ级，GUS染色程度很浅，仅≤1/3面积的幼胚能够着色(图3)。结果发现，柱头滴加法GUS表达效率明显高于子房注射法，分别为17.33%、9.33%(表2)。此外，经柱头滴加法进行花粉管通道转化油葵28 d后取未成熟胚进行组织染色，可观察到转化材料可被染为蓝色(图4)。说明GUS基因在油葵种子上不仅转化后3 d能够瞬时表达，而且转化后 28 d 也能够表达，28 d表达率分别为11.92%、3.98%，差异显著(表3)。因此，油葵花粉管通道法转基因方法中柱头滴加法优于子房注射法。

2.3 转胰岛素基因油葵的获得

2.3.1 4种转化方法转胰岛素基因油葵的PCR检测 本试验研究的4种方法都获得了转胰岛素基因PCR阳性植株(图5)，去1张子叶法和花粉管通道法比较适宜，其余2种方法也能够获得转基因PCR阳性植株，但从转化率方面和操作简便易行方面优选去1张子叶转化和花粉管通道转化的方式，作为后续研究油葵的主要转化方式。

表1 2种转化方法材料的GUS瞬时表达效率比较(去1张子叶转化法和温室子叶节转化法)

2.3.2 去1张子叶法T0和T1代转胰岛素基因油葵的获得 去1张子叶法转化油葵，转化操作时间点的选择对转化效率影响很大。结果(图6)表明，种子萌发后36 h对萌发的种子切去1张子叶，然后进行农杆菌侵染，转化后抗性率和阳性率明显高于其他处理，分别为12.83%、3.17%。

表2 2种转化方法材料的GUS瞬时表达效率比较(柱头滴加法和子房注射法)

表3 柱头滴加法和子房注射法转化后3、30 d材料的GUS表达效率比较

供试的600株去1张子叶无菌苗经农杆菌侵染、筛选、移栽或嫁接，共得到40株完整抗性植株(T0代)，经检测得到19株T0代阳性植株(表4)，PCR检测转化率可达到 3.17%。培养过程中，由于离体培养的部分植株瘦弱，生根困难，移栽后很难成活。针对此问题，将嫁接的方法应用于本研究中，即使是无根组培苗，通过嫁接也可得到完整植株。但是，因嫁接成活率和抗性植株强壮程度不确定，得到完整抗性植株数量仍然较少。从T0代植株上收获种子，播种长出T1代植株，取其幼嫩叶片提取基因组，PCR结果显示，8个T0代阳性植株的后代均检测到阳性T1代植株。但该方法由于侵染和培养过程中对幼苗有伤害，T0代植株得到的种子量较少，每株植株仅5～30粒种子。

2.3.3 花粉管通道法(柱头滴加法)转胰岛素基因油葵的获得 利用花粉管通道柱头滴加转化法转化600朵小花，结实率可达52.83%，转化率为10.83%(表5)。为获得更高的转化效率，本试验研究了人工授粉后柱头剪切时间对结实率和转化率的影响。结果表明，授粉后5～9 h结实率、5～7 h转化率均显著高于其他处理(图7)。综合考虑，授粉后5～7 h是花粉管通道柱头滴加法最佳操作时间，利用此方法对油葵进行转化，可获得转胰岛素基因油葵阳性植株(图8)。此方法也可作为油葵转基因研究的主要技术方法之一。

表4 农杆菌介导的去1张子叶侵染法对油葵的转化

表5 花粉管通道(柱头滴加法)对油葵的转化

3 讨论与结论

利用GUS组织化学染色的方法可以方便直观地分析转基因效果，这在前人研究中已有报道[13-14]。本研究也利用这种方法筛选出适宜油葵基因转化的方法，而后续研究证明花粉管通道柱头滴加转化法和去1张子叶转化法是油葵转基因切实可行的方法，并由此得到了转化植株和后代。

有研究发现，温室子叶节转化法在大豆转基因研究中的效果良好[14]。而本研究发现去1张子叶转化法优于子叶节转化法，其原因可能是种子萌发的过程中，在无菌条件下更容易把握去除成熟胚生长点的时机。而温室条件下，种子萌发过程须要拱土，这需要2～3 d的时间。试验发现，当种子萌发后，多数生长点已经长出幼叶，错失了拔除生长点的有利时机。因此，对于油葵转基因来说，去1张子叶转化法更为适宜。然而受限于转基因植株本身的生理状况，去1张子叶转化法所得到的种子数量有限，这给后代遗传分析和纯系的筛选会造成不利影响。这些问题有待进一步解决。

本研究发现，对于花粉管通道的2种方法而言，柱头滴加法优于子房注射法，原因可能是油葵小花数目多，尺寸小，子房相对较小，而且管状花的构造不利于找准子房位置，给操作带来不便；且子房注射法对子房和胚珠有不同程度的伤害，影响结实率，这和前人的研究观点[15-18]一致。对于柱头滴加法，操作时间对结果影响很大，时间太短花粉管没有生长，则质粒DNA无法随花粉管导入，时间太长受精已经完成，也失去导入时机。本研究发现，对油葵花粉管通道柱头滴加法转化时机应选择人工授粉后5～7 h，结实率和转化率均较高。

本试验利用GUS组织化学染色的方法比较了4种油葵转基因方法的效果，并通过转化胰岛素基因对转化方法进行了验证，优选出去1张子叶转化法和花粉管通道转化法，这2种方法可作为后续研究油葵的主要技术手段，可为向日葵等菊科植物基因工程育种研究提供技术方法的参考。

参考文献：

[1]Molinier J，Thomas C，Brignou M，et al. Transient expression ofiptgene enhances regeneration and transformation rates of sunflower shoot apices (HelianthusannuusL.)[J]. Plant Cell Reports，2002，21(3)：251-256.

[2]Sujatha M，Vijay S，Vasavi S，et al.Agrobacterium-mediated transformation of cotyledons of mature seeds of multiple genotypes of sunflower(HelianthusannuusL.)[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2012，110(2)：275-287.

[3]Hewezi T，Perrault A，Alibert G，et al. Dehydrating immature embryo split apices and rehydrating withAgrobacteriumtumefaciens：a new method for genetically transforming recalcitrant sunflower[J]. Plant Molecular Biology Reporter，2002，20(4)：335-345.

[4]Neskorodov Y B，Rakitin A L，Kamionskaya A . Developing phosphinothricin-resistant transgenic sunflower (HelianthusannuusL.) plants[J]. Plant Cell Tissue and Organ Culture，2010，100(1)：65-71.

[5]Sawahel W，Hagran A. Generation of white mold disease-resistant sunflower plants expressing human lysozyme gene[J]. Biologia Plantarum，2006，50(4)：683-687.

[6]Lucas O，Kallerhoff J，Alibert G. Production of stable transgenic sunflowers (HelianthusannuusL.) from wounded immature embryos by particle bombardment and co-cultivation withAgrobacteriumtumefaciens[J]. Molecular Breeding，2000，6(5)：479-487.

[7]Kirches E，Frey N，Schnabl H. Transient gene expression in sunflower mesophyll protoplasts[J]. Plant Biology，2015，104(3)：212-216.

[8]黄俊轩，李建科，李双跃，等. 油葵基因转化体系的建立[J]. 北方园艺，2010(13)：176-178.

[9]焦 展，安胜军，邵铁梅，等. 油葵转化体系建立和重组人胰岛素的初步表达[J]. 西南农业学报，2016，29(11)：2682-2687.

[10]Rao K S，Rohini V K.Agrobacterium-mediated transformation of sunflower(HelianthusannuusL.)：a simple protocol[J]. Annals of Botany，1999，83(4)：347-354.

[11]王关林，方宏筠. 植物基因工程[M]. 北京：科学出版社，2009：428-430.

[12]Jefferson R A. Assaying chimeric genes in plants：theGUSgene fusion system[J]. Plant Molecular Biology Reporter，1987，5(4)：387-405.

[13]刘 栋，石 强，李鹏丽，等. 利用GUS基因瞬时表达对大豆子叶节和胚尖转化方法的比较及优化[J]. 生物学通报，2008，43(12)：35-39.

[14]李丹丹，张 洁，刘 娜，等. 农杆菌介导的大豆子叶节非组织培养遗传转化体系优化[J]. 植物遗传资源学报，2012，13(5)：789-797.

[15]张美善，卢 敏，陈展宇，等. 利用外源DNA导入技术培育向日葵育种新材料[J]. 吉林农业大学学报，2001，23(1)：18-20.

[16]师校欣，杜国强，王晓蔓，等. 花粉管通道法遗传转化核桃的研究[J]. 园艺学报，2012，39(7)：1243-1252.

[17]刘 昊. 核桃花粉管通道遗传转化体系的建立[D]. 北京：中国林业科学研究院，2012：33-34.

[18]王曾姿之. 罗汉果DNA导入水果型黄瓜的研究[D]. 长沙：湖南农业大学，2015：29-32.