谢景梦 孟辰颖 李二粉 张英侠 宋旭琴 张媚玉 贺利民

摘 要 建立了简单、灵敏、可靠的液相色谱-串联质谱测定猪尿中玉米赤霉醇及其类似物、氯霉素、五氯苯酚等10种违禁物质的分析方法。猪尿样品分别采用冻干法和QuEChERS法前处理，乙腈和5 mmol/L乙酸铵溶液作为流动相，梯度洗脱，分析物经Zorbax SB-C18色谱柱分离，在电喷雾负离子模式下，采用四极杆质谱仪进行多反应监测分析。在实验浓度范围内，10种分析物基质匹配标准曲线线性良好，相关系数（R2）均大于0.99； 在5、10及20 μg/L添加浓度水平，两种前处理方法所得10种分析物的回收率分别为80.7%～107.7%和73.5%～103.3%，相对标准偏差均低于15%，检出限和定量限分别为0.1～2.0 μg/L和0.2～5.0 μg/L。本方法可满足生猪体内多种违禁物质的快速筛查监测要求。

关键词 违禁药物； 冻干法； QuEchERS法； 液相色谱-串联质谱法； 猪尿

1 引 言

现代畜牧业生产过程中，兽药在畜禽疾病的预防、治疗及改善动物性食品品质方面起着重要的作用[1]。农业部235号公告规定31种兽药禁止用于所有食用动物，9种兽药可用于治疗但不得在动物性食品中检出[2]。但是滥用药物或者违规使用违禁药物的现象仍常常发生，造成兽药在动物性食品中残留，对人类健康、畜牧业发展及生态环境均造成严重危害。近年，在动物性食品中检出违禁药物的报道较多[3～5]，建立高效、灵敏和可靠的动物中违禁药物监测方法对确保食品动物质量安全具有重要意义。

目前，各国规定食品中有害物质的限量水平越来越低，因此需要更灵敏的检测手段和更有效的前处理技术分析复杂食品基质中的有害物质[6]。动物源性食品及尿液、粪便等排泄物样品基质复杂，违禁药物含量低，理化性质差异大，对违禁药物多残留分析样品前处理技术提出了更高要求[7-8]。冻干溶剂置换法和QuEChERS（Quick， Easy， Cheap， Effective， Rugged and Safe）法因其独特优势，在动物性食品、环境水及土壤等复杂基质中多类药物残留分析中均有很多报道[9～16]。大部分药物在动物体内不能被完全吸收，通常以原型或代谢物的形式随尿液或粪便排出体外。相比于其它组织样品，尿液在采集过程中可减少对活体动物的影响，适合作为大规模安全监管的检测介质[17]。孙晓亮等[18]采用MCX柱净化，王丽君等[19]则采用分子印迹固相萃取净化，均建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定猪尿液中β-受体激动剂类违禁药物残留方法。QuEChERS法和冻干法都是猪尿中违禁物质的有效监测手段，而根据违禁药物的化学组成、结构特性和酸碱性，按正、负两种电离模式进行分类监测将大大提高分析和监测效率。基于LC-MS/MS电喷雾正离子监测模式，本研究组已建立了液相色谱-串联质谱测定猪尿中23种禁用药物的分析方法[20，21]。

玉米赤霉醇及其类似物和己烯雌酚具有激素作用药物，能够提高饲料转化率和胴体瘦肉率；氯霉素和硝基酚钠为抗菌药；五氯苯酚在畜牧业生产中主要作为消毒剂，这些药物都禁止用于食品动物或在动物性食品中不得检出，它们的化学组成和结构特性各异，难以通过固相萃取技术净化、富集。为此，本研采用通用性强的冻干法和QuEChERS快速前处理法，基于它们在负离子模式下的共同特性，建立了灵敏和可靠的LC-MS/MS同时监测猪尿中氯霉素、己烯雌酚和玉米赤霉醇类等10种违禁药物的分析方法，对提高生猪生产中违禁物质监测的时效性具有重要的实际意义。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；API 4000电喷雾-串联四极杆质谱仪（美国Applied Biosystems公司）；真空冷冻干燥机（德国Christ公司）。

玉米赤霉醇及其类似物（纯度>98.5%，中国兽药药品监察所）；氯霉素、己烯雌酚及对硝基酚钠（纯度>99.3%，德国Dr. Ehrenstorfer公司）；五氯苯酚（纯度>98.9%，中国农业部环境保护科研检测所）；甲醇和乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher Scientific公司）；N-丙基-乙二胺（PSA，德国CNW公司），C18和石墨化碳（GCB）填料（上海月旭公司）。

标准储备液（100 mg/L）：分别准确称取10种药物对照品， 用甲醇溶解并定容至10 mL，20℃避光保存，12个月。

混合标准工作液（1 mg/L）：分取各标准储备液100 μL于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容，混匀，20℃避光保存，有效期3个月。

2.2 前处理方法

2.2.1 冻干法 取5 mL猪尿置于离心管中，加入适量混合标准工作液，混匀，置真空冷冻干燥机中冻干15 h。残渣用2 mL 50%（V/V）乙腈-水溶液超声复溶，15000 r/min离心10 min，取上清液，待测。

2.2.2 QuEChERS法 取5 mL猪尿置于离心管中，依次入加10 mL乙腈、4 g无水MgSO4和1 g NaCl，振荡离心后，取上层转移至装有200 mg PSA的离心管中，涡旋，8000 r/min离心10 min，移取上清液，吹干，残渣用1 mL 50%（V/V）乙腈-水复溶，过0.22 μm滤膜，待测。

2.3 LC-MS/MS分析条件

2.3.1 液相色谱条件 Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3.5 μm）；流速0.3 mL/min；流動相A为乙腈，B为5 mmol/L乙酸铵溶液。梯度洗脱：0.0～4.0 min，15% A；4.0～10.0 min，70% A；10.1 min，15% A。

2.3.2 质谱条件 电喷雾电离负离子模式，电喷雾电压4000 V，离子源温度550℃，雾化气压力60 psi， 辅助气压力65 psi，气帘气压力25 psi。

3 结果与讨论

3.1 仪器条件优化

3.1.1 质谱条件选择 在负离子模式下，对10种药物进行母离子和子离子扫描，优化的质谱参数见表1。

3.1.2 液相色谱条件选择 比较了Agilent Zorbax SB-Aq与SB-C18（150 mm × 2.1 mm i.d.， 3.5 μm）和CNW Athena C18-WP （150 mm × 2.1 mm i.d.， 5 μm）3種色谱柱和乙腈（甲醇）-水、乙腈（甲醇）-5 mmol/L 乙酸铵溶液和乙腈（甲醇）-水（含0.1%氨水）流动相体系对10种药物的分离效果。结果表明，以乙腈-5 mmol/L乙酸铵溶液体系为流动相，10种药物在SB-C18色谱柱上分离最好，峰形对称尖锐。

3.2 冻干法的复溶效果

为了有效溶解冻干试样中的目标分析物，且最大限度减少基质中杂质的溶出，考察了30%乙腈（甲醇）、乙腈（甲醇）（含5 mmol/L乙酸铵）、30%乙腈（甲醇）（含5 mmol/L乙酸铵及0.01%氨水）的复溶效果。结果表明，甲醇溶液体系作为复溶液，因大量杂质同时复溶而影响分离和电离，存在较严重的基质抑制效应，分析物回收率均较低。而含乙腈的3种复溶体系，分析物的回收率都较高，且相差不大。因此，最终选择乙腈-水体系作为复溶液。进一步比较10%、30%、50%、80%及100% （V/V） 乙腈作为复溶液时分析物的回收率。结果表明，随着复溶液中乙腈含量增加，回收率逐渐提高；50%和80%乙腈为复溶液，分析物回收率都达到80%以上，但纯乙腈为复溶液，药物的回收率反而降低，且80%以上乙腈为复溶液，分析物的色谱峰变宽，并出现拖尾现象。因此，选择50% （V/V）乙腈-水作为猪尿样品冻干残渣的复溶液。

3.3 QuEChERS法

3.3.1 提取 QuEChERS法用于残留分析时，常使用乙腈作为提取剂[22]。QuEChERS法通常用无水MgSO4作为脱水剂，并加入NaCl等盐类，从而形成饱和盐溶液与有机相分层，促使待测物从水相转移到有机相中。经优化后的乙腈提取液体积、无水MgSO4及NaCl用量分别为10 mL乙腈、4 g无水MgSO4和1 g NaCl。

3.3.2 净化 比较了吸附剂PSA、C18和GCB对待测物回收率的影响。结果表明，PSA净化效果最好，10种分析物的回收率均达80%以上；C18的回收率较低，其中五氯苯酚和对硝基酚钠的回收率低于20%，其它药物也低于50%；GCB的回收率最低，五氯苯酚和α-玉米赤霉烯醇的回收率<5%。可能主要是后二者在吸附杂质的同时也大量吸附了分析物。进一步优化了PSA用量，实验表明， PSA用量小于150 mg时，净化效果不理想，基质效应较强；采用200 mg PSA净化猪尿样品，去杂效果最好，基质效应最小，分析物回收率均大于75%。

3.4 方法学验证

3.4.1 选择性 将空白猪尿分别按照冻干法和QuEChERS法进行处理，得到的冻干法空白猪尿添加10种违禁物质和空白猪尿的MRM质量色谱图如图1所示，目标化合物出峰时间附近没有干扰峰，峰形尖锐对称，与杂质分离良好，方法选择性好。

3.4.2 标准曲线与线性范围 在0.1～200.0 μg/L浓度范围内，采用冻干法和QuEChERS法测定10种药物的线性关系良好， 相关系数（R2）均大于0.99。

3.4.3 回收率与精密度 低、中、高（5， 10 和20 μg/L）3个添加浓度水平的猪尿样品，除QuEChERS法的五氯苯酚回收率约75%外，其余分析物的回收率都大于80%，10种分析物的批内和批间精密度（RSD）均小于20%，冻干法和QuEChERS法的结果分别见表2和表3。

3.4.4 检出限与定量限 配制一系列浓度的基质匹配标准工作液，按3倍信噪比（S/N）计算方法检出限，10倍信噪比计算定量限，冻干前处理方法的检出限和定量限如表2，QuEChERS法的检出限和定量限见表3。冻干法的10种分析物的检测限和定量限分别为0.1～2.0 μg/L和0.2～5.0 μg/L；QuEChERS法的分别为0.1～1.0 μg/L和0.2～2.0 μg/L，两种方法都具有较高的灵敏度。

3.5 冻干法和QuEChERS法的比较

本研究建立的基于冻干和QuEChERS两种前处理技术快速检测猪尿中10种违禁物质方法，两种方法都具有较高的灵敏度和回收率，满足残留分析检测要求。与传统的提取和净化过程相比，两种方法具有操作简单、通用性强、有机试剂用量少和药物损失少等优点。

与QuEChERS法相比，冻干法所需时间相对较长，基质效应大。同时，由于QuEChERS法采用PSA固相分散吸附杂质，净化效果好，一些药物的检出限低于冻干法。但是QuEChERS法在前处理过程中添加盐类和吸附剂，可能会使药物少量损失，回收率略低于冻干法。两种方法各有优缺点，均符合残留分析检测要求，可根据实际情况选择两种方法。

3.6 实际样品分析

500份不同来源的猪尿样品，按照建立的基于QuEChERS前处理技术的LC-MS/MS方法分析监测，其中1份猪尿试样检测出约0.83 μg/L的氯霉素，其它违禁物质均未检出。检出氯霉素的阳性猪尿试样用冻干法复测，测定值为0.97 μg/L。

4 结 论

建立了猪尿中6种玉米赤霉醇类化合物、氯霉素、己烯雌酚、五氯苯酚以及对硝基酚钠共10种违禁物质快速筛查的液相色谱-串联质谱分析方法。冻干法和QuEChERS法两种前处理方法均操作简单，都获得了较好的回收率与高的灵敏度，建立的方法可用于猪尿样品中10种违禁物质的同时快速监测。

References

1 FENG Bing， WANG Shuo. Food Research and Development， 2007， （01）： 158-162

冯 冰， 王 硕. 食品研究与开发， 2007， （01）： 158-162

2 Maximum Residue Limits of Veterinary Drugs in Animal Derived Food. MOA， Bulletin 235， 2002， Annex 3 and 4

动物源性食品中兽药最大残留限量. 农业部235号公告， 2002， 附录3和4

3 YAN Zhong-Yong， ZHANG Xiao-Jun， MEI Guang-Ming， LI Pei-Pei， LONG Ju， ZHU Yin， WANG Jian. Food Sci.， 2014， 35（16）： 153-159

嚴忠雍， 张小军， 梅光明， 李佩佩， 龙 举， 祝 银， 王 建. 食品科学， 2014， 35（16）： 153-159

4 GAO Yu-Feng， ZHEN Zhen-Peng， ZHANG Lin， CHEN Hong-Xiang， YU Gou-Bin， GUO Jian-Xiong， LI Hai-Qiao. Chin. J. Food. Hygi.， 2016， 28（3）： 372-374

高裕锋， 甄振鹏， 张 琳， 陈红香， 余构彬， 郭剑雄， 李海乔. 中国食品卫生杂志， 2016， 28（3）： 372-374

5 Chen X B， Wu Y L， Yang T. J. Chromatogr. B， 2011， 879（11）： 799-803

6 WANG Fei， JIANG Hong， ZHENG Ping. Anhui Chemical Industry， 2007， （06）： 3-7

王 飞， 蒋 闳， 郑 屏. 安徽化工， 2007， （06）： 3-7

7 ZHANG Yi， YUE Zhen-Feng， GUO Wen， WU Shao-Jing， SHEN Jin-Can， XIAO Chen-Gui， LIN Li， HUA Hong-Hui， HOU Le-Xi， YI Bing-Qing. Food Sci.， 2016， 37（1）： 213-221

张 毅， 岳振峰， 郭 文， 吴绍精， 沈金灿， 肖陈贵， 林 黎， 华红慧， 侯乐锡， 易冰清. 食品科学， 2016， 37（1）： 213-221

8 LIU Qing-Yan， LUO Fang-Mu. J. Instr. Anal.， 2009， 28（5）： 589-591

刘庆艳， 罗芳苜. 分析测试学报， 2009， 28（5）： 589-591

9 Jiménez V， Companyó R， Guiteras J. Food Chem.， 2012， 134（3）： 1682-1690

10 Wang L Q， Zeng Z L， Wang Z， Guo J Y， He L M. Food Anal. Method， 2016， 9（7）： 1904-1911

11 Bourdatdeschamps M， Leang S， Bernet N， Daudin J J， Nélieu S. J. Chromatogr. A， 2014， 1349： 11-23

12 Villar-Pulido M， Gilbert-López B， García-Reyes J F， Martos N R， Molina-Díaz A. Talanta， 2011， 85（3）： 1419-1427

13 Lopes R P， Reyes R C， Romero-González R， Frenich A G， Vidal J L M. Talanta， 2012， 89： 201-208

14 ZHAO Dong-Hao， WANG Qiang， WANG Xu-Feng， LI Zhi-Guang， HUANG Ke， LI Liu-Dong. Chinese Fishery Quality and Standards， 2017， （03）： 30-37

赵东豪， 王 强， 王旭峰， 黎智广， 黄 珂， 李刘冬. 中国渔业质量与标准， 2017， （03）： 30-37

15 Yu Y， Liu X W， He Z Y， Wang L， Luo M， Peng Y， Zhou Q W.Anal. Methods， 2016， 8（11）： 2463-2470

16 Hu F Y， He L M， Yang J W， Bian K， Wang Z N， Yang H C， Liu Y H. J. Chromatogr. B， 2014， 949-950（4）： 79-86

17 LI Xiao-Min， GAO Yan， SU Xiao-Ou， LI Yang， WANG Rui-Guo， ZHANG Yu， FU Jian-Jie. Chinese J. Anal. Chem.， 2014， 42（12）： 1779-1784

李晓敏， 高 燕， 苏晓鸥， 李 阳， 王瑞国， 张 瑜， 傅建捷. 分析化学， 2014， 42（12）： 1779-1784

18 SUN Xiao-Liang， LI Xue-Lian， CAO Xu-Min， YANG Yan-Fei， WANG Juan， WANG Shu-Ting， WANG Yu-Dong， WANG Xiao-Yin， QU Zhi-Na， ZHAO Si-Jun.Chinese J. Anal. Chem.， 2017， 45（1）： 124-132

孙晓亮， 李雪莲， 曹旭敏， 杨艳菲， 王 娟， 王淑婷， 王玉东， 王晓茵， 曲志娜， 赵思俊. 分析化学， 2017， 45（1）： 124-132

19 WANG Li-Jun， CAO Xu-Min， SUN Xiao-Liang， WANG Shu-Ting， LIU Jing， HAO Zhi-Hui， QU Bao-Han， ZHAO Si-Jun. Chinese Journal of Chromatography， 2016， 34（3）： 240-248

王丽君， 曹旭敏， 孙晓亮， 王淑婷， 刘 静， 郝智慧， 曲宝涵， 赵思俊. 色谱， 2016， 34（3）： 240-248

20 WANG Xu-Feng， ZHAO Li， ZHANG Gao-Kui， YANG Jian-Wen， BIAN Kui， WANG Zong-Nan， YANG Hai-Cui， HE Li-Min. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（8）： 1254-1258

王旭峰， 赵 丽， 张高奎， 杨建文， 卞 愧， 王宗楠， 杨海翠， 贺利民. 分析化学， 2013， 41（8）： 1254-1258

21 Wang X F， Liu Y H， Su Y J， Yang J W， Bian K， Wang Z N， He L M. J. Agric. Food Chem.， 2014， 62（2）： 516-527

22 DONG Jing， GONG Xiao-Ming， ZHANG Li， SUN Jun， WANG Hong-Tao. Chin. J. Health Lab Technol.， 2008， 18（1）： 26-28

董 静， 宫小明， 张 立， 孙 军， 王洪涛. 中国卫生检验杂志， 2008， 18（1）： 26-28