刘佳蓉 黄忠平 刘会君 王丽丽 刘春胜 任一平 史鸿鑫

摘 要 建立了一种实时直接分析-质谱法（DART-MS）用于饮料（水、碳酸饮料、啤酒）和尿液中γ-羟基丁酸（GHB）快速检测。样品经甲醇-水（1∶1， V/V）溶液稀释后，在负离子模式下，以选择离子扫描（SIR）模式进行直接定量分析。离子化气体温度为 350℃，进样速率为0.5 mm/s。针对水样、碳酸饮料、啤酒、尿液样品，本方法的检出限（S/N=3）为1～2 μg/mL，定量限（S/N=10）为3～5 μg/mL。标准曲线线性相关系数为0.9899～0.9980，加标回收率为80.8%～115.2%，相对标准偏差为1.9%～12.8%。本方法具有样品前处理简单、分析速度快、成本低等优点，有望在大批量饮料和尿液样品的快速筛查分析中发挥作用。

关键词 实时直接分析-质谱法；γ-羥基丁酸；快速筛查

1 引 言

γ-羟基丁酸（γ-Hydroxybutyric acid，GHB）是一种常见的滥用药物，被用作镇静剂和麻醉剂，过度使用会造成暂时性失忆，甚至导致死亡。我国和美国都将其列为管制药物。GHB具有强烈的镇静及健忘效应，易溶于大多数液体基质中，且无色无味，因此常作迷药用于药物辅助性犯罪[1]。对于服用GHB者，尿液中GHB浓度明显高于内生浓度水平（低于10 μg/mL），因此尿液是检测GHB极具参考价值的生物样本，有必要建立快速灵敏的检测饮料和尿液中GHB的方法。

目前，GHB的检测方法有显色法、红外光谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、离子色谱法及核磁共振法等。Alston等[2]用化学显色法作为初步筛选药物的方法，但该方法检出限高，且易受干扰； Witkowski等[3]采用傅里叶变换红外法（FTIR）用于GHB的快速筛查，但定量分析存在不足； 色谱-质谱联用是使用最广泛的方法之一，Lenz等[4]在酸性条件下将γ-羟基丁酸（GHB）转变为γ-丁内酯（GBL），浓缩后采用顶空进样方式的气相色谱-质谱联用法（GC-MS）分析； 孟品佳等[5]用五氟卞基溴烷基化衍生后，对衍生物进行了质谱解析，然而提取和衍生化的过程复杂且耗时； Busardo等[6]采用HPLC-MS/MS法检测血浆、尿液、脑脊髓液和头发中的GHB，尽管避免了GC-MS中将GHB进行内酯化或者衍生化的样品前处理问题，但仍然需要耗时的色谱分离，且使用的串联质谱价格昂贵，不利于推广。Liu等[7]采用二维离子色谱法测定了人尿样品中GHB含量，通过离子排斥色谱柱消除尿液基质干扰，再利用柱切换技术，采用离子交换色谱柱测定GHB，由于需要对仪器进行改装，且使用实验室自制离子交换色谱柱，不利于推广。Palomino-Schtzlein等[8]利用核磁共振对尿液和血清中的GHB进行定性和定量检测，在NMR分析中，体液中大分子重叠共振，严重干扰了GHB的检测。Saar-Reismaa等[9]利用毛细管电泳法测定人唾液样本中的GHB，但毛细管电泳中电渗流的不稳定性经常引起迁移时间的变化。

实时直接分析离子源（DART）是一种新型的敞开式非表面接触型解析/离子化分析技术，可分析各形态样品，无需繁杂的前处理和冗长的色谱分离过程，分析速度为秒级，可实现对目标物的实时定性与定量分析[10]。Bennett等[11]将DART与飞行时间质谱仪（TOF）联用，检测饮料中GHB； Chen等[12]将DART与四极杆-轨道离子阱质谱（Q-Orbitrap）联用，用于检测包括GHB在内的多种街头药物。但上述工作均未进行GHB的准确定量分析，且未涉及尿液样本的检测； 同时，飞行时间质谱和四极杆-离子阱质谱比单四极杆质谱价格昂贵，测试成本高，不利于普及使用。

本研究采用实时直接分析-单四极杆质谱法，建立了快速检测饮料及尿液中的GHB的方法。本方法无需复杂的样品前处理过程，分析速度快，且单重四极杆质谱成本相对较低，体积小，更易于推广，饮料及尿液样本的同时测定更利于刑事案件的侦查。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

实时直接分析离子源DART SVP（美国Ion Sense公司）； ACQUITY QDa质谱检测器（美国Waters公司）； 3K15离心机（德国Sigma公司）、UPR-II-5T超纯水仪（四川优普超纯科技有限公司）、VX-200涡旋搅拌器（美国Labnet公司）、AR223CN电子天平（美国Ohaus公司）、KH7200DB型超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）。

甲醇（色谱纯，德国 Merck 公司），实验用水为经UPR-II-5T超纯水仪制备的超纯水； γ-羟基丁酸（美国Cerilliant公司）。3种饮料样品购于当地超市，分别为水、无色碳酸饮料和啤酒； 尿液样品由志愿者提供。

2.2 溶液配制

称取GHB标准品0.01 g （精确到0.001 g），以超纯水溶解并定容至10 mL，配制成1000 μg/mL的单标储备液，于4℃保存。使用前以甲醇-水（1∶1， V/V）稀释成不同浓度的标准溶液。

碳酸饮料、啤酒的标准溶液：取碳酸饮料和啤酒各10 μL，加入适量标准储备液，用990 μL甲醇-水（1∶1， V/V）稀释成不同浓度的标准溶液。

模拟样品的配制： 在空白样品中添加适量的标准溶液，制得不同浓度的阳性样品。配制的模拟水样中GHB浓度约为20、40和80 μg/mL，以甲醇稀释1倍后进样； 碳酸饮料和啤酒中GHB浓度约为1000、2000和4000 μg/mL，以甲醇-水（1∶1， V/V）稀释100倍后进样； 尿液中GHB浓度约为200 μg/mL， 以甲醇-水（1∶1， V/V）稀释10倍后进样。

2.3 样品前处理

饮料：水样取500 μL，加入500 μL甲醇，过0.22 μm滤膜后进样； 对于碳酸饮料和啤酒，取10 μL样品，加入990 μL甲醇-水（1∶1， V/V）稀释，经0.22 μm滤膜过滤后检测。

尿样：取尿样100 μL，加900 μL甲醇-水（1∶1， V/V），涡旋混匀，以10000 r/min离心5 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后检测。

2.4 实时直接分析离子源条件和质谱条件

负离子模式采集数据，离子化气体为高纯氦气，氦气的流速为3 L/min，气体离子化温度为350℃； 采用12 Dip-it Samplers 模式进样，用玻璃棒蘸取适量溶液置于自动进样架上，待溶液挥干后进样，进样速率为0.5 mm/s，栅极电压为200 V， 离子源出口距质谱进口约2.4 cm。在负离子模式下，选择离子扫描模式（SIR）采集数据，锥孔电压为8 V，母离子m/z 103.3。

3 结果与讨论

3.1 質谱条件的优化

在选择离子扫描模式下，分别采用正离子模式和负离子模式对GHB进行一级质谱分析，得到其分子离子峰。如图1所示，GHB在正负离子模式下均有响应，但在负离子模式下GHB的信号强度明显优于正离子模式，因此本研究选择负离子模式进样。在此条件下，优化锥孔电压，使分子离子峰达到最大响应值，最终确定锥孔电压为8 V。

3.2 DART条件的优化

3.2.1 离子化温度 DART利用高温激发态的等离子体对待测样品进行解吸离子化，因此离子化温度是需要优化的重要参数。温度过高或过低，都会影响DART的离子化效率和背景噪音。高温会加速待测样品的热解吸率，使更多的待测样品进入质谱检测器，进而增强响应。然而，过高的温度会导致待测样品在热解吸过程中降解，降低灵敏度[13]。本研究考察了离子化气体温度在300～450℃范围内对GHB离子化效率的影响，发现离子化温度为350℃时，信号响应最高，如图2所示。

3.2.2 样品传输速度 DART软件能控制线性轨道上dip-it玻璃棒的移动速度，玻璃棒蘸取待测样品后引入质谱仪分析。玻璃棒通过电离区域的速度对样品信号响应强度有较大的影响。本研究考察了样品传输速度为0.2、0.5和0.8 mm/s时GHB的峰形和离子响应强度。如图3所示，当样品传输速度较慢时，有利于离子化气体与样品充分接触，从而提高离子化效率，但峰形变宽。综合考虑峰形、分析速度及离子响应强度等因素，最终确定以0.5 mm/s的速度进行样品传输。

3.3 方法学考察

水样的基质较为简单，用甲醇-水（1∶1， V/V）稀释1倍后直接进行分析。碳酸饮料和啤酒的基质成分较复杂，在制作标准曲线时应考虑基质效应。基质效应的评价公式为：基质效应=（1-基质空白溶液的加标信号强度/空白溶剂的加标信号强度） ×100%[14]。经计算碳酸饮料和啤酒的基质效应>15%，故以空白碳酸饮料和啤酒为溶剂配制一系列不同浓度的GHB标准溶液。由于碳酸饮料中含有较多的糖类，样品黏度大，而啤酒中的成分较为复杂，基质浓度过高时，样品液膜太厚，可能无法实现目标分析物的瞬间气化，直接进样后得到的选择离子流图出现了裂峰现象。本实验采用甲醇-水（1∶1， V/V）稀释碳酸饮料和啤酒样品，考察稀释倍数（10、20、50和100倍）对峰形及信号响应的影响。结果表明，稀释100倍后直接进样可以消除选择离子流图的裂峰现象。

尿液样品通过甲醇-水（1∶1， V/V）稀释10倍后进样，结果表明，尿液的基质效应小于15%，属于低基质效应影响，故在实际定量分析过程中采用与水样相同的标准曲线。

饮料（水、碳酸饮料、啤酒）和尿液的工作曲线方程如表1所示，其线性范围均为5～100 μg/mL，线性相关系数R>0.98，方法的相对标准偏差为4.1%～5.7%，检出限（S/N=3）为1.0～2.0 μg/mL，定量限（S/N=10）为3.0～5.0 μg/mL。

3.4 模拟样品分析

在实际的刑事案件中，饮料中GHB的浓度范围在1.7～21.1 mg/mL之间[11]。由于阳性的实际样品难以获取，本实验通过加标的方式配制模拟阳性样品。在适量饮料样品中添加GHB标准品，使饮料中GHB的含量分别约为1000、2000和4000 μg/mL。对于刑事案件中的尿液样品，Bosman等[15]报道在疑似药物服用的不同案件中尿液样品中GHB浓度范围为14～2000 μg/mL。LeBeau等[16]也报道了一例疑似药物辅助性犯罪（DFSA）案件中，尿液中GHB的浓度为308 μg/mL。采用在阴性尿液中添加GHB标准品的方式配制模拟阳性尿液样品，使尿液中GHB的含量约为200 μg/mL。按照2.3节的方法对上述配制的模拟样品进行简单前处理后，进行检测。

稀释后的模拟阳性样品测得的质谱图见图4，测得的GHB浓度如表2所示。加标回收率在80.8%～115.2%之间，相对标准偏差为1.9%～12.8%，表明本方法具有较好的准确度和重现性。

4 结 论

本研究建立了一种饮料和尿液中快速筛查GHB的DART-MS方法，样品前处理过程简单快速，操作方便，可对实际饮料样品（水、碳酸饮料、啤酒）以及尿液中的GHB进行快速筛查，且DART-MS仪器成本低，体积小。本方法可应用于现场快速检测，可为司法鉴定中涉及GHB的案件提供技术支持。

References

1 Drasbek K R， Christensen J， Jensen K. Acta Neurol. Scand.， 2006， 114（3）： 145-156

2 Alston W C， Ng K. Forensic Sci. Int.， 2002， 126（2）： 114- 117

3 Witkowski M R， Ciolino L A， Defrancesco J V. J. Forensic Sci.， 2006， 51（2）： 330-339

4 Lenz D， Kroener L， Rothschild M A. J. Chromatogr. A， 2009， 1216（18）： 4090-4096

5 MENG Pin-Jia. Chinese J. Anal.Chem.， 2008， 36（1）： 61-65

孟品佳. 分析化学， 2008， 36（1）： 61-65

6 Busardo F P， Kyriakou C， Marchei E， Pacifici R， Pedersen D S， Pichini S. J. Pharmaceut. Biomed.， 2017， 137（1）： 123-131

7 Liu J， Deng Z， Zhu Z， Wang Y， Wang G， Sun Y， Zhu Y. J. Chromatogr. A， 2017， 1528（1）： 35-40

8 Palomino-Schtzlein M， Wang Y， Brailsford A D， Parella T， Cowan D A， Legido-Quigley C， Pérez-Trujillo M. Anal. Chem.， 2017， 89（1）： 8343-8350

9 Saar-Reismaa P， Vaher M， Kaljurand M， Kulp M， Mazina-Sinkar J. Anal. Methods， 2017， 9（21）： 3128-3133

10 Cody B R， Laramée J A， Durst. Anal. Chem.， 2005， 77（8）： 2297-2302

11 Bennett M J， Steiner R R. J. Forensic Sci.， 2009， 54（2）： 370-375

12 Chen T H， Hsu H Y， Wu S P. Forensic Sci. Int.， 2016， 267（1）： 1-6

13 Wang L， Zhao P， Zhang F， Bai A， Pan C. J. AOAC Int.， 2013， 96（2）： 353-356

14 KONG Cong， ZHOU Zhe， WANG Yang， HUANG Yuan-Fei， SHEN Xiao-Sheng， HUANG Dong-Mei， CAI You-Qiong， YU Hui-Juan. Chinese J. Anal.Chem.， 2017， 45（2）： 245-252

孔 聰， 周 哲， 汪 洋， 黄原飞， 沈晓盛， 黄冬梅， 蔡友琼， 于慧娟. 分析化学， 2017， 45（2）： 245-252

15 Bosman I J， Lusthof K J. Forensic Sci. Int.， 2003， 133（1-2）： 17-21

16 LeBeau M A， Montgomery M A， Miller M L， Burmeister S G. J. Anal. Toxicol.， 2000， 24（6）： 421-428