孙岩 肖楠 李光 韩燕燕 刘淑莹 王恩鹏 陈长宝

摘 要 建立了超高效液相色谱-三重四级杆质谱（UPLC-QQQ-MS）检测大鼠血浆中G-Re含量的方法，用于比较研究人参皂苷Re（Ginsenoside Re， G-Re）在正常大鼠和UVB辐射损伤模型大鼠体内的药代动力学行为。选用Ascentis Express C18 色谱柱（5.0 mm × 3.0 mm，2.7 μm），以0.1%甲酸-乙腈为流动相，梯度洗脱。电喷雾离子源（ESI）在负离子模式下，选择多反应监测模式（MRM）扫描，内标法定量，用于G-Re定量分析的离子为m/z 991.54/945.53/475.60。方法检出限为4.0 ng/mL，定量限为13.5 ng/mL，G-Re在15～20000 ng/mL范围内线性关系良好（r =0.999）；日内和日间精密度、回收率、基质效应和稳定性均能满足药代动力学分析要求。结果表明，两组大鼠分别单次口服50 mg/kg G-Re后，体内代谢过程表现皆符合二室模型特征， 正常组和模型组t1/2α分别为（0.21±0.04）h和（0.69±0.07）h，t1/2β分别为（17.08±0.53）h和（21.40±16.77）h，AUC（0-t）分别为（321.91±2.27） g/（L·h）和（474.99±194.96）g/（L·h），AUC（0-∞）分别为（332.44±1.66） g/（L·h）和（518.64±231.39）g/（L·h），除t1/2α外，两组之间的药代动力学参数具有显著差异（p<0.05）。本方法准确、灵敏、专属性强、稳定性好，可用于人参皂苷Re的体内药代动力学比较研究。

关键词 人参皂苷Re； 中波紫外线辐射； 药代动力学

1 引 言

紫外线辐射具有强烈的生物学效应，长期暴露于紫外辐射，尤其是中波紫外线（Ultraviolet B，UVB），对皮肤可产生强烈的光损伤，被照射部位真皮血管扩张，皮肤会出现红斑、炎症、老化现象，严重者可引发皮肤癌[1～5]。过量的UVB照射可导致机体中超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）下降，由照射产生的自由基及活性氧可以攻击免疫器官，导致其氧化损伤，免疫细胞的及细胞因子分泌发生改变，继而机体的免疫功能逐渐减弱，甚至产生免疫抑制作用[6～8]。药物代谢动力学是定量研究药物在生物体内吸收、分布、代谢和排泄规律，并运用数学原理和方法阐述血药浓度随时间变化的规律的学科。近年来，质谱技术在药代动力学研究方面的应用较为广泛[9～11]，但是机体受UVB辐射损伤状态下的相关代谢研究鲜有报道。

人参（Panax ginseng C.A.Mey.）具有良好的抗辐射功效，人参皂苷作为人参的主要活性成分之一，在抗氧化、清除氧自由基和抗衰老等方面具有较强的活性[11～15]。人参皂苷Re的质量分数约占总皂苷的30%，具有清除自由基，保护不饱和脂肪酸等活性，有显著的抗衰老功效，发挥着重要的抗肿瘤和抗癌作用[16～20]。

本研究利用超高效液相-质谱联用技术，检测人参皂苷Re经正常和UVB辐射损伤模型大鼠口服后的血药浓度变化情况，计算相关的药代動力学参数，比较两组间的差异，为初步揭示紫外线辐射对机体代谢的影响提供理论依据，同时也对人参皂苷Re的药用开发与基础研究提供了参考。

2 实验部分

2.1 仪器与试剂

1200型液相色谱系统，6520 Accurate Q-TOF仪， TSQ ENDURA质谱仪，配有ESI离子源及Xcalibur数据处理系统，均购自美国Agilent公司；Thermo UltiMate 3000系统；TDL-5-4型离心机（Anke公司），WS2-261-79高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；超低温冰箱（美国热电公司）；窄谱中波紫外线光源采用飞利浦紫外线灯（TL-01，峰值311～313 nm）；紫UV-340A外线辐照计（台北路昌公司）。

乙腈（色谱级，美国Tedia公司）；甲酸（色谱级，美国Sigma公司）；人参皂苷Re和人参皂苷Rf对照品（纯度>98%，吉林大学有机化学教研室）；超纯水由美国Millipore公司的Milli-Q系统制得。

2.2 实验动物

雄性Wistar大鼠12只，体重（180±20） g，动物合格证号：SCXK-（辽）2015-0001，由辽宁长生生物技术有限公司动物中心提供。在标准环境下（湿度 50%±10%；温度（25±2）℃；12 h 昼夜循环）进食进水，放入代谢笼内适应性饲养3天，实验前禁食12 h，实验过程中所有动物都受到精心养护。

2.3 色谱与质谱条件

Ascentis Express C18 色谱柱（5.0 mm×3.0 mm，2.7 μm），柱温35℃。流动相为0.1%甲酸溶液（A）-乙腈（B），梯度洗脱程序：0 min，20% B；0～2 min，20% B；2～4 min，20%～35% B；4～7 min，35%～41% B； 7～9 min，41%～70% B；9～10 min，70%B。 流速 0.3 mL/min；进样量5 μL。

质谱条件：碰撞气为超纯氦，鞘气和辅助气为高纯氮；电喷雾电离（ESI），检测模式为负离子模式；鞘气压力：35 psi；辅气压力：10 psi；离子转运管温度：325℃；气化温度：275℃；采用多反应监测（MRM）方式检测。

2.4 溶液配制及样品处理

2.4.1 标准溶液及内标溶液的配制 称取人参皂苷Re 标准品1.00 mg，用甲醇稀释至1.0 mL，配成浓度为1.0 mg/mL母液，然后用甲醇稀释成0.5、1.0、10.0和100.0 μg/mL的工作液。称取人参皂苷Rf 标准品1.00 mg，以甲醇定容至1.0 mL，配制成1.0 mg/mL的内标溶液，然后用甲醇稀释成1.0 μg/mL的工作液。

2.4.2 标准曲线的绘制 取空白大鼠血浆100 μL 于1.5 mL Eppendorf 管中，每个样品中加入不同质量的人参皂苷Re，配成15、25、50、100、250、500、1000、2500、5000、10000和20000 ng/mL的系列标准溶液，加入100 μL 1 μg/mL人参皂苷Rf 作为内标， 混匀，加入200 μL冰甲醇，涡旋30 s，12000 r/min离心10 min，取上清液，经0.22 μm滤膜过滤后进样检测。以G-Re 浓度为横坐标x，以G-Re 与G-Rf的峰面积比值（A/Ai）为纵坐标y，进行直线回归，得标准曲线。

2.5 实验方法

参考文献[21]的方法对大鼠造模[21]，取上述雄性大鼠12只，用婴儿理发器剃除整个大鼠背部（尾部至颈部）的绒毛，每2天剃毛1次，实验前随机分成空白对照组与UVB模型组，每组6只。UVB照射时，大鼠背部暴露在距光源30～42 cm处，每次剂量为170 mJ/cm2，连续UVB照射5天，从第6天开始，每2天照射一次，共14天（10次），UVB总剂量为2.38 J/cm2，照射后送回动物饲养室。

空白对照组与UVB模型组继续按照上述照射条件饲养至第15 d，口服G-Re皂苷（混悬于0.5% CMC-Na） 50 mg/kg剂量混合液，在0.08、0.17、0.33、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12、24、36、48和72 h眼眶取血，每个时间点取血0.5 mL，血液冷却后3000 r/min离心10 min，取上清血浆100 μL，测定前加入100 μL G-Rf内标液和 300 μL冰甲醇，涡旋30 s，以12000 r/min离心10 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，于4℃保存， 待测。

3 结果与讨论

3.1 质谱条件的鉴定及优化

利用高分辨飞行时间质谱仪在负离子模式下对人参皂苷Re、Rf进行定性分析，结果见图1。分别在正、负离子模式下，采用直接进样方式，优化G-Re和内标G-Rf的三重四级杆质谱的分析条件：毛细管电压为2.0 kV；离子传输管温度为200400℃；雾化器温度为200400℃；鞘气流速2050 psi；辅助气流速0.3 L/min；自动优化G-Re和内标G-Rf在多反应检测（MRM）时所产生的碎片离子种类和所需碰撞能量。本研究选择负离子模式进行分析，详细参数见表1。

3.2 方法学考察

3.2.1 专属性 将供试空白血浆与空白血浆中加入待测物和内标物后得到的总离子流图（Total ion chromatorgram， TIC）和给药后不同时间实测色谱图进行比较。结果表明，血浆中所含内源性物质不干扰被测物和内标物的测定，被测物峰形良好。G-Re和内标G-Rf 的保留时间分别为4.61和6.52 min。空白大鼠血浆样品，空白大鼠血浆中加入G-Re和内标G-Rf样品，给药1 h后的大鼠血浆样品如图2所示。

3.2.2 线性关系 将G-Re与内标G-Rf的峰面积比值（y）与G-Re浓度（x）进行最小二乘线性回归。结果表明，在15～20000 ng/mL浓度范围内，线性关系良好，得到标准曲回归方程为y=0.0003x+0.0009（R=0.999）， 检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为4.0 ng/mL和13.5 ng/mL。

3.2.3 精密度与准确度 采用高、中、低3个浓度的G-Re血浆QC样本，每个浓度进行6个样本分析，连续测定3天，计算日内和日间精密度和准确度，结果见表2。日内和日间精密度的相对标准偏差（RSD）均小于5%，表明本方法的精密度和准确度良好。

3.2.4 回收率 分别取G-Re高、中、低3个浓度的QC样本，每个浓度进行6个样本分析，将空白血浆中先加入G-Re，处理后计算所测得峰面积，与空白血浆处理后加入相同量G-Re所测得峰面积比值的百分率进行比较，考察样品的提取回收率，结果见表2。G-Re回收率范围为89.6%～91.9%， RSD<15%， 表明本方法可以满足血浆类生物样本的检测要求。

3.2.5 基质效应 分别取G-Re高、中、低3个濃度的QC样本，与等量G-Re的纯标准溶液的峰面积相对应，测量基质效应， 基质效应（%）=A/B×100， 其中A为QC样本中测得G-Re的峰面积， B为等量G-Re标准溶液的峰面积，每个浓度进行6个样本分析，结果如表2所示，G-Re在3个浓度下的基质效应在93.2%～97.8%之间，表明本方法可有效避免基质对人参皂苷Re测定的影响。

3.2.6 稳定性 分别取G-Re高、中、低3个浓度的QC样本，在不同的储存条件（室温24 h，20℃至少15天，3次冻融循环后和4℃下保存8 h）下， 3个QC水平的测定结果见表3。结果表明，在上述条件下，人参皂苷Re样本溶液较为稳定，可满足分析要求。

3.3 人参皂苷Re的药代动力学比较研究

利用本方法研究大鼠口服50 mg/kg的G-Re后的药代动力学行为。用DAS 2.0软件对数据进行处理，其主要药代动力学参数详见表4。图3为口服后空白组和模型组大鼠的平均血液药物浓度-时间曲线， 通过赤池信息标准（Akaike's information criterion， AIC） 进行房室模型分析，结果表明，G-Re在两组大鼠体内代谢符合二室模型特征。经统计学t检验分析，与正常状态下的药动学参数比较， 在UVB辐射条件下， G-Re在大鼠体内的t1/2β、 AUC、 Tmax和K21均高于正常组，两者之间有显著性差异（p<0.05），提示在UVB状态下G-Re在大鼠体内的吸收明显升高，而Cmax、 K12和K10无统计学差异，提示在大鼠体内的消除没有发生明显变化[22]。有研究报道，在辐射剂量为800 mJ/cm2 UVB急性照射下，即可导致裸鼠肝细胞GSH与SOD活性水平显著下降[23]。本实验在UVB照射剂量下，模型组大鼠肝脏可能造成了一定的氧化损伤，从而导致其对G-Re的吸收、分布、代谢及排泄过程产生了影响[23] 。

本实验建立了UPLC-QQQ-MS/MS 法对正常和UVB辐射损伤模型大鼠体内G-Re含量的快速检测方法。利用超高效液相色谱-三重四级杆质谱联用的优势，对质谱参数进行了优化，对检测的G-Re和内标G-Rf都分别选择一个定性离子对和一个定量离子对，最终实现对G-Re的定量分析。此方法可在10 min内完成G-Re的分析，检测时间短、线性关系较好、方法回收率高、稳定性良好，可满足分析要求。本实验对正常大鼠和UVB辐射大鼠体内的人参皂苷Re药代动力学比较研究，对比两组代谢检测结果，UVB辐射条件下测得大鼠体内的人参皂苷Re含量较高，说明中波紫外线影响人参皂苷Re在动物体内代谢过程，其详细机制有待于进一步研究。

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