◎ 吕海鹏，王亚飞，许贝贝

（中检集团中原农食产品检测（河南）有限公司，河南 郑州 450000）

随着近年来环境污染的加剧，人们对于饮用水的要求不断提高，包装饮用水产业取得飞速发展[1]。但与此同时，国内外关于包装饮用水中检出大肠菌群和铜绿假单胞菌的报道也逐渐增多，引起了诸多学者和消费者的普遍关注。大肠菌群为一群在37 ℃条件下培养24 h能发酵乳糖、产酸、产气，且需氧和兼性厌氧的革兰阴性无芽孢杆菌的统称，多存在于温血动物粪便中，人、畜粪便对外界环境的污染是大肠菌群在自然界存在的主要原因[2]。因此，大肠菌群被国际上公认为检测各种水质、医药及食品在卫生学上安全性的指示菌[3]。铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，PA）是一类生长条件要求低、耐不良环境能力强、氧化酶阴性的革兰氏阴性杆菌，在空气、土壤、水、人体皮肤、呼吸道和肠道等环境中有广泛的分布，是一种常见的条件致病菌[4]。其具有易定植、易变异、耐药机制复杂等特征，导致桶装饮用水污染事件逐渐增多，甚至引起食物中毒[5]，国际食品法典委员会（Codex Alimentarius Commission，CAC）、国际食品微生物标准委员会（ICMSF）及我国国家标准均有对铜绿假单胞菌指标的检测[6]。

为了检测某市市售包装饮用水中微生物的污染情况，根据GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》中微生物限量要求，对所有样品进行了大肠菌群和铜绿假单胞菌检测，并对检测结果进行了统计学分析。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

BSC-1300ⅡA2型生物安全柜（苏净安泰）、DNP-9272 型恒温生化培养箱（上海精宏实验设备有限公司）、高压蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂）、MFS-3A-250K 不锈钢过滤系统（广东环凯微生物科技有限公司）、台式多功能紫外分析仪。

结晶紫中性红胆盐琼脂、煌绿乳糖胆盐肉汤、无菌生理盐水、假单胞菌琼脂基础培养基、乙酰胺肉汤、纳氏试剂、金氏B培养基、绿脓菌素测定用培养基、氧化酶试纸、无菌微孔滤膜（直径47 mm，孔径0.45μm）（广东环凯微生物科技有限公司）。

阳性对照菌铜绿假单胞菌（ATCC27853，ATCC）、大肠埃希氏菌（ATCC25922、广东省食品微生物安全工程技术研究研发中心）。

1.2 样品来源

检测45份样品全部来自该市在售的包装饮用水，产品包装规格为300 mL～1.5 L的瓶装水样品38批次，4.5 L～19 L的桶装纯净水19批次，所有样品均在保质期内。

1.3 检测方法与依据

根据GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》[7]中微生物限量要求，采用GB 4789.3-2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》[8]第二法平板计数法和GB 8538-2016《饮用天然矿泉水检验方法》[9]分别对样品进行大肠菌群和铜绿假单胞菌的检测，最后采用阳性菌株做质控，参照GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》进行合格性评价，同时采用Excel数据处理软件对数据进行统计处理，不合格率的显著性比较用x2检验。

2 结果与分析

2.1 不合格率

采用GB 4789.3-2016[8]平板计数法进行大肠菌群检测，57批次样品中有3批次样品至少有1份样品检出大肠菌群，36 ℃条件下在结晶紫中性红胆盐琼脂平板培养24 h后，出现紫红色菌落且周围有红色胆盐沉淀环，接种煌绿乳糖胆盐肉汤48 h后产气，判定为3批次为大肠菌群阳性。大肠菌群不合格率为5.26%。检测结果如图1所示。

采用GB 8538-2016[9]中铜绿假单胞菌检测方法进行检测，57批次样品中有12批次样品至少有1份样品中检出铜绿假单胞菌，依据GB 8538-2016[9]对可疑菌落进行生化鉴定，结合阳性菌株作为对照，判定为12批次样品为铜绿假单胞菌阳性。铜绿假单胞菌不合格率为21.05%。检测结果如图1所示。

图1 57批次包装饮用水中微生物项目不合格率统计图

2.2 不合格率分析

本实验所抽取的水样有瓶装饮用水和桶装饮用水两类，对两类样品的不合格率进行了统计分析，其中桶装饮用水中铜绿假单胞菌的不合格率为52.63%，大肠菌群不合格率为15.79%；瓶装饮用水铜绿假单胞菌不合格率为5.26%，大肠菌群检出率为0，同时检测出大肠菌群的3批次样品中也检出了铜绿假单胞菌，而瓶装饮用水中未发现大肠菌群污染，检测结果如图2所示。同时对大肠菌群的不合格率进行相关性分析，结果表明，不同包装间的差异有统计学意义（x2=6.35，P=0.012，P＜0.05）；对铜绿假单胞菌的检出率进行相关性分析结果表明，不同包装间的差异有统计学意义（x2=9.07，P=0.003，P＜0.05）。

图2 桶装饮用水和瓶装饮用水微生物项目不合格率统计图

3 结论

根据GB 19298-2014《食品安全国家标准 包装饮用水》[7]中微生物限量要求，每批次样品的5份平行样品中，均不得检出铜绿假单胞菌。本次抽检的市售包装饮用水样品中合格率为78.95%，铜绿假单单胞菌检出导致的不合格率达21.05%，这与前人报道结果接近[10]，说明目前该市包装饮用水还存在致病菌污染的问题。目前，有报道称铜绿假单胞菌属于食源性和水源性致病菌，且铜绿假单胞菌的生长会对产品亚硝酸盐含量等理化性状造成影响，导致经济损失得以发生[11]。在国内外许多国家和地区已经将大肠菌群作为判断食品中是否有粪便污染的重要指示菌，本研究中检测出大肠菌群的3批次样品中也检出了铜绿假单胞菌，说明桶装饮用水在生产过程中存在微生物污染的风险；且3批次样品均为都是小型生产企业生产的桶装饮用水，可能是这些生产企业对生产过程中卫生状况未引起足够的重视，导致出现了微生物污染状况，实验结果分析铜绿假单胞菌与大肠菌群检验结果无显著相关性，这与报道的研究结果过一致[12]，骆业巧研究结果表明饮用水中指示菌的检出已相对独立，与其他微生物是否检出已无必然联系，两种微生物的引起污染的方式不同[10]，但该市在同一批次样品中同时检出两种微生物，说明这些企业的生产过程中的消毒卫生状况堪忧。

桶装饮用水的铜绿假单胞菌不合格率高于瓶装饮用水，说明桶装饮用水在生产过程中存在更高微生物污染的风险。经调查发现，瓶装饮用水由于清洗消毒相对比较简单，污染往往发生在灌装环节[13]，然而从结果来看，该市生产企业已引起足够重视。而小型的桶装包装饮用水生产企业往往消毒处理设施比较简单，而且环境潮湿，对于微生物的繁殖十分有利，这就导致无法控制铜绿假单孢菌的繁殖生长。大桶清洗难度相对较大，多数生产企业采用未经处理的水清洗车间和桶，这直接导致冲洗过程也可能造成微生物二次污染，引起更多包装饮用水桶的污染[13-15]，这就导致检测过程中同一批次中5份样品均检出铜绿假单胞菌。

本研究结果表明，该市市售包装饮用水存在微生物污染安全隐患，尤其是铜绿假单胞菌。因此，生产企业在生产过程中应该严格把控质量，应提高安全卫生意识，同时食品监管部门应在生产加工过程中加强监督和卫生培训工作，切实保障消费者的身体健康。

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