熊青 宋姣敏 崔萌 许颖妍 俞滢 叶乃兴 陈桂信

摘 要 为了研究茉莉花花香代谢相关分子机制，本研究基于茉莉花转录组测序结果，采用PCR技术从双瓣茉莉花花瓣的cDNA文库中克隆出苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonia lyase，PAL）的全长cDNA，命名为JsPAL2。该cDNA的全长为2 181 bp，其中ORF为2 079 bp，编码693个氨基酸的蛋白，分子量为75 599.19 u。序列分析结果表明，该基因编码的氨基酸序列与油橄榄（Olea europaea ）的PAL具有82%的同源性。利用100 μmol/L的外源激素茉莉酸甲酯（methyl jasmonate，MeJA）喷施成熟花苞，并采用荧光定量PCR技术检测JsPAL2在茉莉花发育过程、开放过程以及经MeJA处理过后花朵中的表达量变化。结果表明，在花蕾生长发育时期，JsPAL2的表达量随着天数的增加而升高，在5 d时达到最高；在不同开放时期，18：00花朵未开放时JsPAL2表达量最低，22：00花朵半开放时表达量最高；经外源茉莉酸甲酯处理后，JsPAL2的表达量明显增加，在处理后7 h达到最高，随后逐渐降低，推测该基因可能与茉莉花香气物质的合成有关，同时MeJA可能对其表达有诱导的作用。

关键词 茉莉花；PAL基因；生物信息学；茉莉酸甲酯；荧光定量PCR

中图分类号 S31 文献标识码 A

Abstract To explore the mechanism of fragrance metabolism in Jasminum sambac， the full-length of cDNA of phenylalanine ammonia-lyase （PAL） named JsPAL2 was cloned from the petals. Results showed that the full-length of the cDNA was 2 181 bp， including an ORF of 2 079 bp， encoding 693 amino acids with 75 599.19 u molecular weight. The results of alignment of amino acids had a homology of 82% to that of olive （Olea europaea ）. Exogenous hormone methyl jasmonate with concentrate at 100 μmol/L was used to spray mature buds， fluorescent quantitative PCR was used to detect the change of gene expression in the process of growth and development， openning time and treatment of MeJA of flower. Results showed that the expression of JsPAL2 rised as days increased during growth and development period， reaching the top at 5 d； during openning time， the expression of JsPAL2 was minimum at 18：00 when flower was not open， reaching to maximum at 22：00 when the flower was half opennin： after the treatment of MeJA， the expression of JsPAL2 had an obvious increase， reaching the top in 7 h， and then reduced gradually.

Keywords Jasminum sambac； PAL gene； bioinformatics； methyl jasmonate； fluorescent quantitative PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.015

茉莉花[Jasminum sambac（L.）Ait]是木犀科茉莉属香料植物，属典型的气质花[1]，但只在夜晚开花吐香，其独特的花香使之成为窨制花茶和香料提取的重要原材料。植物产生花香的物质通常有萜类、苯丙烷类和脂肪酸等，主要通过萜类代谢途径、苯丙烷类代谢途径、酯类代谢途径和脂肪酸代谢途径调控合成。茉莉花的香气物质中烯类化合物、苯丙烷类物质释放量最大，其中苯甲酸甲酯、水杨酸、水杨酸甲酯、甲基丁子香酚等主要香气物质可通过苯丙烷类代谢途径调控合成[2]。

PAL是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的关键限速酶，催化苯丙氨酸形成肉桂酸，促进植物芳香物质生成[3]，对茉莉花苯丙烷类香气物质形成具有重要作用。1961年，Koukol等[4]首次从大麦中发现了PAL酶，并进行了分离纯化。此后，随着分子生物学和基因工程在植物学研究中的应用，PAL基因的克隆、表达及功能分析得到了廣泛的研究[5]。到目前为止，已经对棉花（Gossypium spp）[6]、甘蔗（Saccharum officinarum）[7]、山药（Dioscoreae rhizoma）[8]、芒果（Mangifera indica）[9]等多种植物的PAL基因进行了cDNA克隆与序列分析。植物PAL基因普遍由小的多基因家族组成，在一组染色体中一般含有2～6个PAL，可以分为2～3个不同类群或亚族。多数PAL有均一的亚基，亚基间的结合非常牢固，因此生物体内的PAL是比较稳定的[10]。苯丙烷类化合物的合成以莽草酸为前体，莽草酸途径途径产生的L-苯丙氨酸经PAL催化生成反式肉桂酸，随后进入苯丙烷代谢途径，经一系列甲基转移酶和酰基转移酶的作用形成各种芳香物质[3]，生成的香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物可进一步转化成香豆素、绿原酸，再进一步转化为类黄酮、木质素、生物碱等[11]，因此，PAL对植物内芳香物质形成、色素形成、植物细胞分化，以及木质化过程、植物抗病抗虫害抗逆境作用等具有重要的意义[12]。

MeJA是一种植物内源激素，最早发现于茉莉属素馨花中，是茉莉花的主要芳香物质，该激素可参与植物的苯丙烷代谢途径[13]。马杰等[14]的研究表明，MeJA处理可以提高鲜切莴苣和甘蓝中PAL的活性，从而也增加了次生代谢如酚类物质的增加，由此推测MeJA可能也会提高茉莉花中PAL的活性，从而诱导芳香物质的产生。而MeJA对茉莉花的处理及研究国内外鲜见报道，且目前对茉莉花香气形成的分子机理研究主要集中在萜类代谢途径，对苯丙烷代谢途径的研究相对较少。本研究利用PCR技术克隆了茉莉花香气形成苯丙烷代谢途径上PAL基因全长cDNA序列，并对其编码产物的理化性质和序列特征进行预测；采用100 μmol/L的外源MeJA处理即将开放的茉莉成熟花苞，通过荧光定量PCR技术对JsPAL2在茉莉花不同生长发育、开放时期以及MeJA处理后花朵中的表达量进行分析，对进一步研究茉莉花释香机理具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料

实验材料为双瓣茉莉花，取自福建农林大学教学茶场茉莉资源圃。于18：00时采摘双瓣茉莉花成熟花苞，稱重并用锡箔纸包裹标记，立即液氮速冻随后存于–80 ℃冰箱备用。对生长发育形态一致的幼小花蕾进行挂牌（记为1天），每天18：00取生长发育1～5 d的花蕾及花苞（未开放）作为荧光定量的材料，每组取3个生物重复，处理同上。对生长发育形态一致且当晚会开放的成熟花苞进行挂牌，取5个不同开放时期（18：00、20：00、22：00、00：00、2：00）的花朵作为荧光定量材料，每组取3个生物重复，处理同上。对生长发育形态一致且当晚会开放的成熟花苞进行挂牌，于17：00时用100 μmol/L浓度的MeJA喷洒茉莉花，同时用水（H2O）处理作为对照组，分别于0、1、3、5、7、9、11、13 h后摘取茉莉花朵，每组取3个生物重复，花朵处理同上。

1.2 方法

1.2.1 JsPAL2编码区全长cDNA的获得 首先提取18：00茉莉成熟花苞的总RNA，采用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒[百泰克生物技术公司（北京）有限公司]，用RNase-free无菌水溶解RNA，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，RNA浓度及D260/230nm、D260/280nm的测定采用核酸蛋白测定仪。随后进行cDNA的第一链合成，参照TransScript Reverse Transcriptase试剂盒（北京全式金生物技术有限公司）说明书进行。分析茉莉花转录组测序结果，下载已有的苯丙氨酸解氨酶基因的一个EST，利用BLAST（https：//blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi）进行分析，其与芝麻（Sesamum indicum）、油橄榄（Olea europae）的相似度均为75%，E value均为0。利用Primer??Pre?mier5软件根据序列设计引物JsPAL2-F和JsPAL2- R（表1），并利用PCR仪进行cDNA扩增，用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，对目的条带进行胶回收，连接pMD18-T载体，转化大肠杆菌T1感受态细胞，挑取阳性单克隆，进行菌液PCR验证，测序工作由上海六合华大生物工程有限公司完成。

1.2.2 茉莉花JsPAL2 cDNA的生物信息学分析 利用BLAST（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast. cgi）分析茉莉花JsPAL2与其他物种氨基酸同源性，利用DNAMAN进行多重氨基酸序列比对，利用MEGA5.2软件构建系统进化树，利用ProtParam、ProtScale软件进行蛋白质基本理化性质预测，利用PSORT Prediction（http：//psort.hgc. jp/form.html）、TargetP 1.1 Server（http： //www.cbs. dtu.dk/services/TargetP/）进行蛋白质亚细胞定位预测，利用TMHMM Server2.0预测蛋白跨膜结构，利用SignalP 4.1 Server进行信号肽预测，利用NetPho 2.0 Server进行磷酸化位点预测，利用Interpro（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html）进行结构域预测，利用在线软件SOPMA和SWISS-MODEL（http：//swissmodel.expasy.org/）分别预测蛋白质二级和三级结构。

1.2.3 茉莉花的MeJA处理 配制浓度为100 μmol/L的MeJA溶液（用无水乙醇作为助溶剂），选取成熟且即将开放的花苞，于17：00时用配制好的MeJA喷施花苞表面，同时用水（H2O）处理另一组茉莉花作为对照，分别于0、1、3、5、7、9、11、13 h后摘取茉莉花朵，每个时期1 g样品，重复3次。

1.2.4 JsPAL2实时荧光定量分析 分别提取花蕾生长发育5个时期（1～5d）、5个不同开放时期（18：00、20：00、22：00、00：00、2：00）以及经MeJA处理后的8个时期的茉莉花瓣总RNA，随后进行逆转录合成cDNA作为荧光定量的模板，方法参照GoScriptTM Reverse Transcription System[购于普洛麦格生物技术（北京）有限公司]说明书进行。根据JsPAL2基因全长cDNA序列设计荧光定量PCR引物rtJsPAL2-F， rtJsPAL2-R（表1）。以茉莉花αTublin2基因为内参，设置3个生物学重复，采用GoTaq ?qPCR Master Mix[购于普洛麦格生物技术（北京）有限公司]试剂盒进行JsPAL2荧光定量PCR扩增。

1.3 数据分析

利用Excel 2003通用2–ΔΔCt法对荧光定量数据进行计算，利用SPSS软件进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 JsPAL2全长cDNA序列的克隆与序列分析

通过PCR技术克隆得到 JsPAL2全长cDNA的PCR产物（图1），测序得到该cDNA全长为2 181 bp，编码693个氨基酸，包含2 079 bp的开放阅读框（ORF，101～2 180 bp）。该基因含有起始密码子ATG、终止密码子TAG，属于Lyase class I_like superfamily，并含有PAL活性位点（图2）。

2.2 JsPAL2的生物信息学分析

JsPAL2氨基酸序列的进化树（图3）显示，植物的PAL基本聚为两大类，两大类中又分为多个小聚类，表明其有较高的同源性，其中甜椒（Capsicum annuum）、马铃薯（Solanum tuberosum）、烟草（Nicotiana attenuata）聚为一类，属于茄科植物；牵牛花（Ipomoea nil）和红薯（Ipomoea batatas）聚为一类，两者都是旋花科植物；粘毛黄岑（Scutellaria viscidula）、罗勒（Ocimum basilicum）和紫苏（Perilla frutescens）聚为一类，属唇形科植物。JsPAL2与油橄榄的亲缘关系最近。不同科属植物间也有较高的同源性，如野茶树[Camellia sinensis（山茶科）]和胡萝卜[Daucus carota（伞形科）]、苹果[Malus x domestica（蔷薇科）]和葡萄[Vitis vinifera（葡萄科）]。

JsPAL2的蛋白质基本理化性质预测与分析结果显示，該蛋白编码693个氨基酸，分子量为75 599.19 u，分子式为C3335H5343N925O1025S25，等电点为5.85，亲水性氨基酸占多数，疏水性氨基酸占少部分，正电荷残基为82个，负电荷残基为71个，不稳定系数为33.87，属于稳定蛋白，总平均亲水性（GRAVY）为–0.186，脂溶指数为91.93。蛋白跨膜结构预测显示其为非跨膜蛋白。亲疏水性预测结果显示，亲水性域所占比例大于疏水性域，推测该蛋白为亲水性蛋白。信号肽预测结果表明，该蛋白分值为0.45，无信号肽，是非分泌性蛋白；结合亚细胞定位预测结果，推测该蛋白最有可能位于细胞质。该蛋白磷酸化位点较多，Ser的磷酸化数量是Thr、Tyr的2倍，位点分布较均匀（图4）。根据结构域分析，该蛋白属于芳香族氨基酸裂解酶家族和苯丙氨酸解氨酶家族，包含3个结构域，分别为Fumarase/histidase N末端结构域、L-aspartase结构域和PAL保护结构域；蛋白质结构预测结果（图5）显示该蛋白有50.94%氨基酸形成ɑ螺旋结构，11.54%氨基酸形成伸展链，29.15%氨基酸形成无规则卷曲，其余8.37%则形成β转角。

2.3 JsPAL2相对荧光定量PCR表达分析

测定JsPAL2在5个花蕾不同生长发育时期和5个茉莉花不同开放时期的表达量，结果表明（图6，图7），在1 d花蕾期时，JsPAL2的表达量最低，随着花蕾的生长发育，其表达量逐渐上调；在茉莉花不同开放时期中，18：00茉莉花未开放时的JsPAL2表达量最低，随着时间的推移呈上调的趋势，在22：00半开放时表达量达到最高，随后呈下调趋势。

2.4 处理组及对照组中JsPAL2相对荧光定量PCR表达分析

测定JsPAL2在茉莉花经MeJA处理及H2O处理后8个时期的相对表达量，结果显示（图8），在H2O处理后1～5 h时间内（也就是18：00—22：00），JsPAL2的表达量逐渐升高，在5 h时（22：00）达到最高，随后5～13 h（也就是22：00—06：00）又逐渐下降；在MeJA处理后1～7 h （18：00—24：00）时间内，JsPAL2的表达量亦逐渐增加，在7 h时（24：00）表达量达到最高，随后下降。对比两次处理可看出，经MeJA处理过后JsPAL2的表达量明显增加，最高表达量接近H2O处理的2倍，且最高表达量的时间也由原先的22：00推移到了24：00。

3 讨论

植物花香成分主要包括萜烯类、苯丙烷类，脂肪族及其衍生物等1 700多种[15-16]。苯丙烷类化合物合成途径是花香物质主要合成途径之一，PAL是苯丙烷代谢途径中的第一个关键限速酶，负责真核生物体内L-苯丙氨酸和反式肉桂酸之间的转化，因此PAL作为生物催化对之后的苯丙烷化合物形成是非常重要的。本研究获得的JsPAL2基因的全长共计2 181 bp的cDNA，通过序列分析显示JsPAL2基因所编码的氨基酸序列含有PAL保护结构域，在168～184氨基酸位点上含有PAL活性位点。JsPAL2与其他植物具有较高的同源性：油橄榄（Olea europaea）87%、芝麻（Sesamum indicum）80%、野生烟草（Nicotiana attenuata）80%。进化树分析发现相同科或类群的植物聚为一类，JsPAL2与油橄榄亲缘关系最近，同时发现不同植物间也有很高的同源性，由此推测PAL作为苯丙烷代谢途径的第一个关键限速酶在进化过程中保持了足够的遗传稳定性，这与前人的研究结果[17]一致。

孙君[3]克隆了茉莉花中PAL基因的cDNA全长，并通过荧光定量PCR对PAL基因在5个不同开花时期（18：00、20：00、22：00、0：00、2：00）的花瓣中的表达进行了分析，结果显示PAL基因在未开放的茉莉花中的表达量比开放的低，并在茉莉花半开时（20：00）表达量最高，随后降低。张芊[18]分别以吐苞2、4 d的花蕾，开放0、12 h以及开败期的茉莉花为荧光定量材料，检测PAL基因在此6个时期的表达量，其结果显示PAL在吐苞2 d、4 d、花开0 h三个时期的表达量依次递增，在花开12 h时表达量达到最高，开败期次之，在吐苞2 d时最低。MeJA作为一种生长调节物质，具有增强植物抗性的作用，其机理涉及改变病程相关蛋白，提高苯丙转氨酶、多酚氧化酶、过氧化物酶等防御蛋白的活性，诱导多酚类化合物等次生物质的产生[19-20]，研究[14]表明MeJA处理鲜切莴苣2 h后PAL活性显著降低，之后缓慢回升，在12 h达到最高值，为对照组的2倍多。同样，处理鲜切甘蓝2 h后PAL活性降低，之后呈单峰变化，在4 h达到最高，是对照组的3倍，说明MeJA通过信号传递功能诱导了PAL活性的增加。Kim等[21]和Gumerova等[22]分别证实了MeJA可以提高甜荞和苦荞中酚类化合物和芦丁的含量，雒晓鹏等[23]以苦荞子叶为材料，经MeJA处理后子叶中总黄酮的含量随着时间逐渐增加，在6 h达到最大值，随后稍降低并保持稳定，PAL是苦荞子叶中黄酮合成关键酶基因，在处理6 h后，子叶中PAL的表达量达到最高，是处理前的2.7倍，且总黄酮含量与PAL的表达量呈正相关，由此可见MeJA也刺激了苦荞子叶中PAL的表达。本研究对JsPAL2在茉莉花生长发育过程和开放过程中的表达动态均进行了分析，另外检测了经8个不同时间MeJA和H2O处理后JsPAL2表达量的变化，以期研究MeJA对茉莉花中苯丙烷类化合物合成的影响。结果表明，在花蕾生长发育过程中，JsPAL2的表达量随着生长发育而升高，在5 d表达量达到最高，说明PAL在花蕾生长发育过程中大量积累形成足够的肉桂酸，为花朵的开放做准备；在开放过程中，茉莉花JsPAL2基因的表达量在18：00未开放时最低，随着开花程度的增加，JsPAL2的相对表达量也持续升高，在22：00花半开时达到最高，随后随着花朵的继续开放而降低，与孙君[3]和张芊[18]研究结果的表达模式大体一致，在茉莉花生长及开放过程中，JsPAL2的表达量与花香强度呈现一定的关联，进一步确定该基因可能参与调控茉莉花苯丙烷类化合物的合成。经MeJA和H2O处理后，JsPAL2表达量的变化趋势与开放过程的变化趋势一致，即先升高后下降；但不同的是，经MeJA处理后JsPAL2表达量明显增加，最高表达量对照组的2倍多，且最高表达量的时间由原先的22：00推移至24：00，即在处理后7 h表达量达到最高，与MeJA对鲜切甘蓝和苦荞子叶的影响相似，说明通过外源施加MeJA能够显著促进JsPAL2表达量的提高，推迟花朵开放后期JsPAL2表达水平的降低，并有可能提高了JsPAL2的活性，从而诱导并激活了茉莉花中苯丙烷物质的合成通路。本研究为解析JsPAL2参与调控茉莉花中苯丙烷物质的合成，以及进一步研究茉莉花释香机制提供了理论基础，但JsPAL2是否调控茉莉花花香物质的合成还需进一步对该基因进行转基因功能鉴定，另外不同浓度MeJA对茉莉花中JsPAL2的表达量是否有不同影响还有待进一步探究。

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