邱振鲁 彭志芸 陈钰涵 李新颜 颜菲菲 曲奕　钟晓璇

摘要 [目的]研究低浓度磷酸盐对铜绿微囊藻和衣藻生长的影响。[方法]以BG-11培养基为基础，配制成不同磷酸盐质量浓度的培养基，使用叶绿素a含量与培养液吸光度作为指标检测铜绿微囊藻和衣藻的生长状况。[结果]磷酸盐是铜绿微囊藻生长的限制性因素，其浓度为0.02～0.10 mg/L时，随磷酸盐浓度增加，铜绿微囊藻生长速率增高，在磷酸鹽质量浓度为0.10 mg/L时，生长情况最好；当浓度达到0.20 mg/L时，生长速率不再增高。而对于衣藻，磷酸盐质量浓度0.01～0.15 mg/L可以促进衣藻的增殖，在质量浓度为0.10 mg/L时，其生长最好；而浓度达到0.20 mg/L时，衣藻的生长出现了轻微的抑制现象。[结论]该研究可为绣源河风景区水体富营养化的评价和预防提供可靠的数据参考。

关键词 磷酸盐；铜绿微囊藻；衣藻；叶绿素a；吸光度；绣源河

中图分类号 S181 文献标识码

A 文章编号 0517-6611（2018）18-0054-03

Effect of Low Concentration of Phosphate on the Growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii in Xiuyuan River

QIU Zhenlu1，PENG Zhiyun2，CHEN Yuhan1 et al （1.College of Chemical and Biological Engineering，Qilu Institute of Technology，Jinan，Shandong 250200；2.College of Biological Science，Sichuan Agriculture University，Chengdu，Sichuan 611130）

Abstract [Objective]The research aimed to study the effect on the growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii under low concentrations of phosphate.[Method] The two alga were cultured in BG11 medium containing different concentrations of phosphate.And this article adopted the content of Chlorophyll a and absorbance of culture medium to indicate the growth of Microcystis aeruginosa and Chlamydomonas reinhardtii.[Result] Phosphate was the limiting factor for the growth of Microcystis aeruginosa.The growth rate of Microcystis aeruginosa increased with the concentration of phosphate increased from 0.02 mg/L to 0.10 mg/L.The optimum concentration of phosphate for the growth of Microcystis aeruginosa was proved to be 0.10 mg/L.But for Chlamydomonas reinhardtii，the growth was proliferated under the phosphate concentration ranged from 0.01 mg/L to 0.15 mg/L.The optimum concentration of phosphate for the growth of Chlamydomonas reinhardtii was proved to be 0.10 mg/L.The growth status was inhibited when the concentration reached 0.20 mg/L.[Conclusion]The study provides a reliable data reference for the evaluation and prevention of eutrophication in Xiuyuan River.

Key words Phosphate；Microcystis aeruginosa；Chlamydomonas reinhardtii；Chlorophyll a；Absorbance；Xiuyuan River

氮磷过多是造成水体富营养化的主要因素。铜绿微囊藻是蓝藻水华中重要的藻类，氮和磷是影响其增殖的重要因素。研究表明，铜绿微囊藻对磷的浓度响应更为敏感[1-3]。关于磷对铜绿微囊藻生长的影响已见报道[4-6]。另有研究表明，铜绿微囊藻在磷营养缺乏的情况下仍能以较高生长速率维持生长数天左右，对水华形成具有重要的作用[7]。衣藻虽然不是水体富营养化的主要藻类，但也有相关衣藻水华的报道，如徐敏等[8]研究了武汉公园小池塘的衣藻水华消长的环境影响因素；朱咏莉等[9]对衣藻水华多次发生的原因进行了分析，其认为衣藻水华加速了水-泥界面磷素的释放，造成部分沉降至底泥表面的藻体增殖和再悬浮。所以，在关注富营养化问题时也不能忽略衣藻的因素。对于小清河章丘段风景化改造的绣源河风景区水体，却鲜见相关研究铜绿微囊藻和衣藻生长条件的报道。笔者对章丘绣源河风景区水体中分离得到的铜绿微囊藻和衣藻分别进行磷酸盐生长影响的探索，在实验室配置不同磷浓度的培养基，使用叶绿素a含量与培养液吸光度2个指标判定2种藻类的生长情况，并与其他水体中相同藻类的研究数据进行对比，以期为绣源河风景区水体富营养化程度的判定、预防和防治提供可靠的数据资料。

1 材料与方法

1.1 仪器 722型分光光度计（上海精密仪器仪表有限公司）、SW-CJ-2F超净工作台（上海一恒科学仪器有限公司）、YXQ-LS-75S立式压力蒸汽灭菌锅（山东鄄城光明仪器有限公司）、光照培养箱（北京永光明医疗仪器厂）、80-2型低速离心机（江苏省金坛市正基仪器有限公司）、JY1002型电子分析天平（上海舜宇恒平科學仪器有限公司）。

1.2 培养基与试剂

每1 L培养基中含NaNO3 1.5 g、KNO3 0.04 g、Na2HPO4 0.04 g、MgSO4·7H2O 0.075 g、CaCl2·2H2O 0.036 g、C6H8O7 0.006 g、FeCl3·6H2O 0.006 g、EDTA-Na2 0.001 g、Na2CO3 0.002 g，微量元素A5 1 mL。

A5微量元素配方：每1 L中含有H3BO3 2.86 g、MnCl2·4H2O 1.86 g、ZnSO4·7H2O 0.22 g、NaMoO4·2H2O 0.39 g、CuSO4·5H2O 0.08 g。

1.3 磷酸盐浓度梯度的配制 向培养基内加入Na2HPO4，使其最终浓度分别为0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L的浓度梯度培养基。

1.4 铜绿微囊藻和衣藻的分离培养

按照《全国湖泊富营养化调查规范》的要求对绣源河进行采样，回实验室后将水样进行梯度稀释并接种在提前配制好的24 h培养无杂菌、杂藻污染的BG-11培养基中，放入光照培养箱中，25 ℃，光暗比12 h∶12 h进行培养，至长出完整的藻落，将藻落在显微镜下进行观察，选出铜绿微囊藻和衣藻，用毛细管吸取单细胞藻体分别接种在新的BG-11培养基中以获得纯种培养。

1.5 藻细胞的磷酸盐饥饿培养及磷酸盐生长影响试验

将分离纯化好的藻种接入BG-11液体培养基内进行扩大培养。将扩大培养后的藻液经过3 d饥饿处理，取20 mL藻液，4 000 r/min，离心10 min，离心后倒掉上清液，加入等体积的NaHCO3溶液（15 mg/L），充分振荡摇匀后，再次离心倒去上清液，反复数次后，向沉淀中加入等量超纯水，摇匀备用[10]。将处理后的藻液接入配制好的不同磷酸盐质量浓度（0、0.01、0.02、0.05、0.10、0.15、0.20 mg/L）的BG-11培养基中，接种量为20 mL。接种完毕，均在自然环境中培养，保证受光充分。pH不得高于8.5。经测定，培养液中的pH为8.0，符合培养条件。

1.6 藻体生长指标的测定

使用叶绿素a含量和培养液吸光度2个指标判定藻体生长状况，从接种开始，每隔48 h测定一次这2个指标。吸光度的测定使用722型分光光度计，铜绿微囊藻测定在450 nm波长下，衣藻测定在470 nm波长下[10]进行。叶绿素a的测定使用甲醇萃取后在665 nm测定吸光度，依据公式

C=吸光度×13.9[11]计算叶绿素的含量（C）。

2 结果与分析

2.1 不同磷酸盐浓度对铜绿微囊藻生长的影响

2.1.1 磷酸盐浓度对叶绿素a含量的影响。

从图1可看出，在不同磷酸盐质量浓度下培养的藻液叶绿素a含量明显不同，但变化周期和规律相对一致，增加速率最快发生在培养的第4～8天。磷酸盐浓度0.01～0.15 mg/L的叶绿素a含量均比对照组高，且在0.02～0.10 mg/L随磷酸盐浓度增加，藻体内叶绿素a含量增大，说明此范围内铜绿微囊藻叶绿素a的合成积累量与磷酸盐浓度增加呈正相关，即此范围内的磷酸盐质量浓度显著促进铜绿微囊藻的叶绿素a合成与生长繁殖，尤其在0.10 mg/L的浓度下，叶绿素a的增长最快，含量最高，说明此浓度是该培养条件下铜绿微囊藻生长的最适磷酸盐质量浓度。当磷酸盐浓度为0.15和0.20 mg/L时，叶绿素a含量与对照组差异不大，可认为此浓度的磷酸盐对铜绿微囊藻的生长无明显作用。

2.1.2 磷酸盐浓度对铜绿微囊藻细胞吸光度的影响。

从图2可看出，在不同磷酸盐浓度下培养的藻液吸光度差异明显，但变化规律与叶绿素a含量一样，也呈现一致性。磷酸盐浓度在0.01～0.15 mg/L时试验组吸光度均高于对照组，且在0.02～0.10 mg/L时试验组的吸光度明显高于对照组，并随磷酸盐浓度增加，培养液吸光度增加，说明此范围内铜绿微囊藻的生长与磷酸盐浓度呈现正相关；另外，在磷酸盐浓度为0.10 mg/L时，藻液的吸光度达到了增加最快，值也达到最大，说明此浓度是铜绿微囊藻的最适磷酸盐浓度。磷酸盐浓度为0.15和0.20 mg/L时，吸光度增加不明显，与对照组差异不大，可认为0.15～0.20 mg/L磷酸盐浓度对铜绿微囊藻的生长无影响。该指标所得数据与上述叶绿素a含量数据呈现一致性。

2.2 不同磷酸盐浓度对衣藻生长的影响

2.2.1 磷酸盐浓度对叶绿素a含量的影响。

从图3可看出，不同磷酸盐浓度下衣藻叶绿素a含量的变化从第6天才开始体现出来。磷酸盐浓度在0～0.15 mg/L时，叶绿素a含量均比对照组高，表明此浓度范围内均可以促进衣藻的生长繁殖。磷酸盐浓度0.01～0.10 mg/L是与衣藻叶绿素a合成量呈正相关的浓度范围，且在磷酸盐浓度为0.10 mg/L时，叶绿素a的含量达到了最高。磷酸盐浓度在0.20 mg/L时叶绿素a的含量比对照组有所降低，说明磷酸盐浓度在0.20 mg/L时会抑制衣藻的叶绿素a合成。

2.2.2 磷酸盐浓度对衣藻细胞吸光度的影响。

从图4可看出，磷酸盐浓度的差异对衣藻培养液的吸光度影响不如其对铜绿微囊藻明显，并且在培养第8天后效果才逐渐显现，磷酸盐浓度在0～0.20 mg/L时吸光度较对照组均有所增加，且在磷酸盐浓度为0.01～0.10 mg/L时，衣藻的吸光度增加最为明显，说明此浓度范围是衣藻生长的最适磷酸盐浓度范围。与叶绿素a指标比较，并没有出现0.20 mg/L吸光度低于对照组的现象，可能是由于在此浓度下藻体细胞死亡仍然有吸光度但是不再合成叶绿素的原因，故认为0.20 mg/L磷酸盐浓度也抑制了衣藻的生长。

3 讨论与结论

该研究中磷酸盐对铜绿微囊藻生长的影响与李夜光等[12]的研究数据基本一致，而与张胜花等[13]、张芹等[14]的研究差异较大，这可能是因为绣源河风景区水体中氮磷浓度一直较低，铜绿微囊藻吸收磷酸盐的能力不强，利用磷酸盐进行代谢的酶活性不高，所以試验中所测得的最适磷浓度低于其他研究。铜绿微囊藻对于磷有较强的储存能力，对营养盐的结合也比其他藻类强，可以更有效地利用营养物质[14-15]，故后续试验中还要进一步延长试验周期，以检测对蓄积磷的利用效果。另外，试验中使用了静置培养的方式，与其他研究中采用的摇床培养相比，不利于藻细胞与营养物质之间的充分混合，也可能是限制铜绿微囊藻利用磷酸盐的因素。造成差异的具体机制后续会通过磷酸盐蓄积试验进行探究。

对于衣藻生长条件的研究所见报道较少，仅见李夜光等[12]的报道，与之相比该研究所测得的衣藻最适生长磷浓度相对较低的原因笔者认为可以同上述铜绿微囊藻的分析。

从绣源河风景区的监测数据来看，该区域水体并未达到富营养化的程度，但是由于其周边不断城镇化的发展，由于山东大学即将迁址绣源河周边，将来难免有更多的生活、试验废水排入绣源河水体，如果不加以严格控制，则水体的富营养化程度肯定会加强。所以对绣源河风景区水域进行富营养化的判定、预防和防治，目前都需要可靠的数据支持与相关技术的不断进步。

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