杨德廉 李祥英 马夙静 赵文超 王大海 管恩森 张英华 孟庆宏 刘振宇

摘要：为实现烟田土壤保育的目标，对长年连作的烟田施用有机肥，采用高通量测序技术，应用Solexa基因组分析平台，测定和分析复合有机肥OFN、OFJ和烟草秸秆有机肥TS对烟田土壤细菌多态性的影响。结果表明，相对于单施化肥，烟田施用有机肥后，烟田土壤细菌OTU、chaol指数和ace指数增大，表明有机肥提高了烟田土壤细菌物种丰富度：细菌丰富度因有机肥种类而不同，并随烟草发育期而产生差异。有机肥对土壤细菌菌群结构影响显著，在门和属的分类水平上，土壤优势细菌种类和比例产生明显改变，特别是有机肥处理可显著提高假丝酵母属细菌的丰度，而降低红色杆菌属、硝化螺旋菌属细菌的丰度。KEGG代谢途径差异分析发现，施用有机肥后土壤细菌代谢路径和代谢路径中基因数量发生改变，而改变了烟田土壤细菌群落功能和细菌代谢。总之，烟田施用有机肥改变了土壤细菌的多态性，并可能达到烟田土壤保育的效果。

关键词：烟田；有机肥；土壤细菌；细菌多态性；土壤保育

烟草生产中存在长期连作且偏重施用化学肥料的现象，导致土层板结，肥力下降，土壤微生物多样性减少，微生物种群趋向单一。土壤微生物在土壤生态系统中具有重要作用，质量好的土壤微生物多态性结构合理，对土壤有机物分解、腐殖质增加、团粒结构形成、速效养分释放和累积、土壤结构改善具有重要意义。土壤微生物多态性反映土壤微生物在其物种丰富度及其种间差异，从一个侧面反映了其群落结构的稳定性，是评价土壤质量重要指标。

施用有机肥是土壤改良的重要手段。研究表明有机肥对良好的土壤结构有着促进作用，可提高土壤的pH值、速效养分的含量，促进植物对养分的吸收，提高作物的产量和质量。有机肥中含有大量易被微生物分解利用的物质，可以刺激微生物迅速生长增殖，显著增加土壤微生物生物量，提高土壤微生物中碳、氮含量以及土壤酶活性，影响土壤微生物多态性。

本研究选取了两种复合有机肥和烟草秸秆有机肥施用于连作烟田，采用高通量测序的方法，探讨施用有机肥后连作烟田土壤细菌多态性特征，以明确不同有机肥对土壤的改良作用。

1材料與方法

1.1试验地点

试验于2015年在山东诸城烟草试验站开展。试验站位于山东省诸城市贾悦镇琅埠村，土壤类型为褐土，土壤基本养分状况为：pH 6.25，有机质15.17 g/kg、全氮636.0 mg/kg、碱解氮63.07 mg/kg、速效磷30.23 mg/kg、速效钾254.66 mg/kg、水溶性氯28.87 mg/kg、交换性钙6455.78 mg/kg、交换性镁118.59 mg/kg。该烟田多年连作，长年单一施用化学肥料。

1.2试验设计

采用大田试验共设3个有机肥处理，以单施化肥作为对照，共4个处理，随机区组设计，重复3次。每个小区长×宽为50 mX6.6 m，以110 cmX55 cm株行距种植烟草6行。供试烟草品种为NC55。具体施肥方案设置如表1：各肥料中养分质量分数如表2。

1.3试验方法

1.3.1土壤取样方法在烟草平预期、采烤前期、采烤后期3个时期，沿每个处理的中间两行烟垄，按“S”型方法在小区的5m、25m、45m处进行土壤取样。选取健康烟株，在距烟草根茎15-20cm处，取10-20cm深度土壤。每个小区取3个样，每个处理共取9个样品，用无菌样品袋保存，冰盒携带，放入-70℃冰箱保存，备用。

1.3.2土壤总DNA的提取和高通量测序DNA提取前将每个处理的9个样品充分混匀为一个混合样，4个处理的3次取样共混合为12个样品，采用Omega试剂盒提取土壤DNA，样品检测合格后，应用Solexa基因组分析平台进行扩增子测序，测序为细菌16S rDNA的v3-v4双可变区域。

1.3.3测序结果分析将原始测序数据去除接头序列，并将双端测序序列进行拼接成单条序列。对每个样板库的单序列基于GreenGene数据库，使用QIIME（version 1.8.0）工具包进行注释，按照97%的相似性阈值将序列划分为不同的OTU（0perational Taxonomic Units），每一个OTU通常被视为一个微生物物种，并对样本数据进行丰富度指数计算、PCA（Princjpal Component Analysis）差异性分析和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genesand Genomes）构成差异分析。

2结果

2.1有机肥对烟田土壤细菌群落丰富度的影响

从12个土壤样品中共获得1167815条原始序列，比较分析得到145 262个OTU，样品文库的覆盖率均大于等于0.89（表3），本次测序数据准确性及真实性较高，可客观反映土壤中微生物的种群结构及差异性特征。结合OTU和群落丰富度指数chaol、ace可见，在烟草的3个生长期，烟田施加有机肥可不同程度的改变烟田土壤细菌的物种多样性和群落丰富度：在平预期，以施用复合有机肥OFJ处理的OTU和群落丰富度指数chaol、ace最高，相较于单施化肥分别提高了14.80%、19.71%、18.17%：在采烤前期，以复合有机肥OFN影响最为明显，相较于单施化肥OTU和群落丰富度指数chaol、ace分别提高了37.26%、35.26%、38.16%：在采烤后期，施用烟草秸秆有机肥的TS处理土壤细菌的群落丰富度指数chaol、ace最高，但OTU略低，而复合有机肥OFJ处理土壤细菌OTU最高。可见，土壤中施用有机肥较单施化肥提高了土壤细菌多样性和丰富度，不同有机肥和不同烟草生长期，这种效应表现有差异。

2.2有机肥对优势菌群结构组成的影响

测序发现，供试3个有机肥和单施化肥的处理，其土壤细菌丰度前10个门均为：酸杆菌门（Acidobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、绿弯菌门（chloroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）、拟杆菌门（Baeteroidetes）、TM7、WS3（图1）。在平预期，3种有机肥处理土壤中丰度位于前10的土壤细菌门中有8个门细菌丰度均较单施化肥处理提高，硝化螺旋菌门丰度均下降，细菌放线菌门丰度OFN、OFJ处理分别较单施化肥处理提高了34.48%、3.27%，但烟草秸秆有机肥TS处理则降低了9.69%。采烤前期，相较于单施化肥，OFN处理中位于前10位的细菌门丰度均提高，其中以TM7、WS3的丰度提升很大，分别为229.41%、244.00%，OFJ处理硝化螺旋菌门较单施化肥下降39.86%，TS处理酸杆菌门和硝化螺旋菌门分别降低了1.05%、51.35%。在采烤后期，3种有机肥处理的土壤细菌在门水平上丰度下降，其中OFN处理的酸杆菌门、放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、厚壁菌门、硝化螺旋菌门丰度下降，OFJ处理的酸杆菌门、放线菌门、硝化螺旋菌门丰度下降，TS处理的酸杆菌门、硝化螺旋菌门丰度下降。可见在门分类水平上，施用有机肥能够引起土壤细菌优势菌群结构的明显变化。

经测序发现，土壤样品中细菌丰度比例最高的前10个属为：Kaistobacter.链霉菌属、红游动菌属、芽孢杆菌属、乳球菌属、假丝酵母菌属红色杆菌属、硝化螺旋菌属、韩国生工菌属、及Steroidobacter（图2）。在平预期，OFN处理土壤细菌丰度位于前10个属中8个属丰度较对照提高，其中假丝酵母菌属提高最大，相较于单施化肥提高848.13%，红色杆菌属、硝化螺旋菌属丰度下降；OFJ和TS处理土壤细菌丰度位于前10个属中的7个属丰度较对照提高，其中假丝酵母菌属提高最大，分别提升了1505.73%和669.71%，该两种有机肥除同样使红色杆菌属、硝化螺旋菌属丰度下降外，还使Steroidobacter丰度下降。在采烤前期，OFN处理的土壤细菌丰度位于10的属细菌丰度均较对照提高，OFJ和TS处理细菌的细菌丰度变化趋势同平顶期一致，同样，3种有机肥处理对假丝酵母菌属丰度提升最大。在采烤后期，TS处理的土壤细菌丰度变化特征与前两个时期一致，OFJ处理中的红色杆菌属、硝化螺旋菌属丰度较对照提高，OFN处理的Kaistobacter.红游动菌属、假丝酵母菌属丰度提高，其他丰度下降。

2.3不同施肥处理间PCA差异显著性分析

对12个土壤样品中OTU组成进行PCA分析，结果见图3。可以看出，3种有机肥处理与单施化肥处理距离较远，表现出有机肥处理与单施化肥处理在OTU组成上的较大差异，而有机肥处理间差异较小：烟草秸秆有机肥TS与复合有机肥OFJ处理的土壤细菌OTU组成差异较小，與复合有机肥OFN处理差异较大。图中也显示，TS、OFJ、单施化肥处理的土壤细菌OTU组成在3个烟草生育期之间差异较小，但OFN处理的则较大。总体表明，烟田施用有机肥，显著改变了土壤细菌OTU组成特征。

2.4 KEGG代谢途径第二层分类差异分析

基于KEGG代谢途径第二等级对有机肥施用后土壤细菌群落功能的差异进行预测，由图4可见，不同分组的样品之间在微生物群落功能基因在代谢途径上存在差异，不同路径基因所占比例的大小不同。相较于单施化肥，烟田施用有机肥OFN后，土壤细菌在基于KEGG代谢途径有5个途径存在显著差异，其中Translation和Immune System Diseases途径基因数量显著提高，而Transcription relatedproteins和Electron transfer carriers途径基因数量降低。而有机肥施用OFJ则引起Transport andCatabolism.Metabolism of Cofaetors and Vitamins、Endocrine System.Function unknown等代谢途径基因数量显著提高，其中Nucleotide metabolism、Transcription related proteins、Metabolism ofCofactors and Vitamins途径的基因数量显著降低。烟草秸秆有机肥TS施入后，引起Translation途径基因数量量显著增加，Metabolism of Cofactors andVitamins途径的基因数量显著降低。可见，有机肥处理使烟田土壤细菌群落功能和代谢产生改变，不同有机肥对土壤细菌代谢路径和代谢路径中基因数量的改变效应表现不同。

3讨论

土壤细菌多态性是土壤质量的综合体现，本研究揭示出不同有机肥均可明显提高土壤细菌的数量和多样性，这跟毛君杰等、徐永刚等发现施用有机肥提高烟田以及其他作物土壤细菌的表现一致。同时，本研究还发现，有机肥对土壤细菌的作用效果跟烟草生育期有一定关系，复合有机肥OFJ和OFN可明显提高烟田土壤细菌在平顶期或采烤前期的OTU和chaol、ace指数，而烟草秸秆有机肥则在采烤后期明显提高土壤细菌chaol、ace指数。研究表明，有机肥施用可影响土壤细菌的优势菌属，调整土壤微生物的群落结构。袁铭章等研究揭示秸秆有机肥增强了土壤酶活性，有利于土壤细菌群落的多样性和稳定性的提高：张云伟等发现有机肥显著提高了烤烟根际的细菌数量和微生物总量，以及烤烟根际放线菌的数量。本研究结果显示，OFN、OFJ和TS3种供试有机肥处理较单施化肥对土壤细菌优势菌属均产生较大影响：3种供试有机肥可提高多数细菌的丰度，但会降低红色杆菌属和硝化螺旋菌属的丰度。本研究基于KEGG代谢途径的预测差异分析，也揭示3种有机肥的施用影响了土壤细菌的功能菌群。

本试验证明烟田施用有机肥能够改善烟田土壤细菌的群落结构，对烟田土壤保育的理论和实践具有一定的指导意义，但需要进一步深入探究土壤细菌响应有机肥的详细机制，更加科学利用有机肥进行土壤保育。

4结论

烟田施用有机肥，可明显改变烟田土壤细菌多态性，明显优于单一施用化肥。有机肥的种类对烟田土壤细菌的数量及物种丰富度、在属水平上的优势菌的影响不同，显示出有机肥种类在土壤改良效应上的不同。在烟草的不同生育期，有机肥对土壤细菌多态性的影响表现有差异，不同有机肥的作用效果呈现不一样的规律，显示出土壤细菌响应有机肥的作用机制差异，和“土壤一土壤细菌一烟草”体系对有机肥存在整体动态响应。总之，有机肥能够改变土壤细菌多态性，对维持烟田土壤生态系统平衡，实现烟田土壤保育有重要作用。