杜岩 郝鹏博 谢秋红 周长清 董思宏 杨蕾蕾 郭卉 任玉卓 刘志强

[摘要] 目的 加强水痘减毒活疫苗生产中猪源材料的外源性病毒的质量控制，防止外源病毒污染。方法 采用酶联免疫法对人二倍体细胞2BS株及胰蛋白酶进行猪细小病毒检测，并对检验方法进行方法学验证。结果 人二倍体细胞2BS株及胰蛋白酶猪细小病毒检测结果均为阴性，且方法学验证中的精密度符合2010版《药品GMP指南》的要求。结论酶联免疫法准确、快速，可用于水痘减毒活疫苗生产中人二倍体细胞2BS株及胰蛋白酶的外源性病毒检测。

[关键词] 水痘减毒活疫苗；猪细小病毒；酶联免疫法；猪源材料

[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1672-5654（2018）03（a）-0140-02

Exogenous Detection of Porcine Materials in Vaccine Production

DU Yan， HAO Peng-bo， XIE Qiu-hong， ZHOU Chang-qing， DONG Si-hong， YANG Lei-lei， GUO Hui， REN Yu-zhuo， LIU Zhi-qiang

Quality Inspection Laboratory， Changchun Qijian Products Co.， Ltd.， Changchun， Jilin Province， 130000 China

[Abstract] Objective This paper tries to strengthen the quality control of exogenous virus of porcine source material in the production of live attenuated varicella vaccine to prevent the exogenous virus contamination. Methods Enzyme-linked immunosorbent assay was used to detect porcine parvovirus in human diploid cell line 2BS and trypsin. The test method was validated by methodology. Results Human diploid cell 2BS strains and trypsinized porcine parvovirus test results were negative， and the methodological validation of the precision in line with the 2010 version of “Drug GMP Guide” requirements. Conclusion Enzyme-linked immunosorbent assay is accurate and rapid and can be used to detect the exogenous virus of human diploid cell 2BS strain and trypsin in live attenuated varicella vaccine production.

[Key words] Live attenuated varicella vaccine； Porcine parvovirus； Enzyme-linked immunosorbent assay； Pig source material

如果在生产者建立细胞库之前，细胞基质在建立或传代历史中使用了胰酶，则所建立的主细胞库或工作细胞库和（或）超过生产限定水平的细胞至少应检测1次与胰酶来源动物相关的外源性病毒包括猪细小病毒[1]，在水痘减毒活疫苗生产过程中胰蛋白酶被广泛应用于细胞培养的细胞分散阶段[2]，故加强胰蛋白酶猪源病毒的检测是十分必要的。该实验采用酶联免疫法（ELISA），对该公司用于生产的工作细胞库、生产用对照细胞、超过生产限定水平的细胞及胰蛋白酶1行猪细小病毒检测，并对此检验方法进行方法学验证[3]，先将检测结果汇报如下。

1 材料与方法

1.1 仪器

EON酶标仪，MK3酶标仪。

1.2 试剂与供试品

①猪细小病毒酶联免疫分析试剂盒。②人二倍体细胞2BS株（工作细胞库批号：2015127、生产用对照细胞批号：37代2015-25-1～6超过生产限定水平的细胞批号：38代2015-25-1～6）。③胰蛋白酶厂家Gibco批号：1629354、1664248，美国BD批号：4028465。④胰蛋白酶：精密称取0.25 g，用PBS稀释成浓度为0.25%的样品溶液。⑤人二倍体细胞2BS株：用PBS稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/mL左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20 min（2 000～3 000 r/min）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

1.3 方法

1.3.1重复性 在同一实验室，由同一分析人员对供试品按试剂盒说明书进行试验，检验3批供试品，每批检验6次。

1.3.2 中间精密度 在同一实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备取同3批供试品按试剂盒说明书进行试验，每批检验6次。

2 结果

2.1 重复性

胰蛋白酶及人二倍体细胞2BS株各三批，每批检验六次，阴性对照、阳性对照均成立，供试品结果均为阴性，试验表明该方法重复性好，稳定可靠。见表1、表2。

2.2 中间精密度

不同时间由不同分析人员使用不同设备（酶标仪）取胰蛋白酶三批，人二倍体细胞2BS株三批分别按试剂盒说明书检验，每批样品检验3次，阴性对照、阳性对照均成立，供试品结果均为阴性，试验表明该方法中间精密度好，受随机变动因素影响较小。见表3、表4。

3 结论

目前国内除无菌试验方法验证有法定的标准要求，其他定性方法并没有相关法定标准，在疫苗生产中，猪源材料来源于动物，对疫苗的安全性有较重要的影响，故加强猪源材料的质量控制是十分必要的。

该文参考2010版《药品GMP指南》对猪细小病毒检测进行方法学验证， 通过方法学验证证明酶联免疫法准确、快速，可用于人二倍体细胞2BS株及胰蛋白酶的猪细小病毒检测。水痘减毒活疫苗所采用的人二倍体细胞2BS株及胰蛋白酶通过该实验已证明无猪细小病毒污染，安全可靠，可用于水痘减毒活疫苗生产。

2015版《中国药典》新增对细胞基质在建立或传代历史中使用了胰酶，應检测与胰酶来源相关的外源病毒，通过该实验保证了该公司生产的水痘减毒活疫苗的安全性，下一步考虑增加其他相关猪源病毒检测。

[参考文献]

[1] 国家药典委员会编.中华人民共和国药典.三部[S].北京：中国医药科技出版社，2015：19-21.

[2] 赵凯，章以浩，李和民.医学生物制品学[M].2版.北京：人民卫生出版社，2007：163-165.

[3] 国家食品药品监督管理局药品认证管理中心编.药品GMP指南[S].北京：中国医药科技出版社.

（收稿日期：2017-12-10）