李沛利　刘丹　陈诗瑶　龚国淑

摘要

为弄清狭叶十大功劳炭疽病的病原菌，从四川省成都市采集疑似为炭疽病的病叶，采用组织分离法分离病原菌，单孢纯化后通过柯赫氏法则验证为致病菌；根据形态学特征，结合多基因系统学，将病原菌鉴定为果生炭疽菌Colletotrichum fructicola。该菌对温度的适应范围较广，10～35℃之间均能生长和产孢，最适生长和产孢温度均为30℃；光照对菌丝生长和产孢影响不显著；在pH 3～11之间均能生长和产孢，菌丝生长最适pH为7，产孢最适pH为4；葡萄糖、甘露醇、乳糖和麦芽糖是菌丝生长的最适碳源，麦芽糖为产孢的最适碳源；蛋白胨是生长和产孢的最适氮源。

关键词

十大功劳； 炭疽病； 病原鉴定； 生物学特性

中图分类号：

S 432.44

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017381

Identification and biological characteristics of the pathogen causing anthracnose onMahonia fortunei in Chengdu， Sichuan

LI Peili， LIU Dan， CHEN Shiyao， GONG Guoshu

（College of Agronomy， Sichuan Key Laboratory for Major Crop Diseases， National Demonstration Center forExperimental Crop Science Education， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract

In order to identify the pathogen causing anthracnose of Mahonia fortunei， small pieces of tissues were taken from the leaves which exhibited symptoms of anthracnose， and through tissue separation， singlespore purification and Kochs postulate， the pathogenic isolate was confirmed. Based on morphological characteristics and multilocus sequences， the isolate was identified as Colletotrichum fructicola. The isolate had a wide range of temperature adaptation； the temperature range for mycelium growth and sporulation was from 10℃ to 35℃ and the optimum temperature was 30℃. The light had no remarkable effect on the mycelial growth and sporulation. The pH range for mycelium growth and sporulation was from 3 to 11， and the optimum pH for mycelium growth and sporulation was 7 and 4， respectively. The optimal carbon sources for mycelial growth were dextrose， mannitol， maltobiose and lactose， and for sporulation， maltobiose. The optimal nitrogen source for mycelial growth and sporulation was peptone.

Key words

Mahonia fortunei； anthracnose； pathogen identification； biological characteristics

狹叶十大功劳Mahonia fortunei（Lindl.） Fedde，又名细叶十大功劳，为小檗科十大功劳属Mahonia常绿灌木[1]。狭叶十大功劳四季常绿、枝叶茂盛，广泛应用于道路、草坪、花坛、池畔作点缀，是重要的园林观赏植物。其根、茎、叶均可入药，有清热燥湿、泻火解毒、滋阴益肺、兼补肝肾等的功效，在治疗湿疹、牛皮癣上也得到充分应用，被誉为“绿色药物”、“天然药物”，可用于开发多种药品[23]。

在四川，狭叶十大功劳市场需求量不断增加，作为重要的绿化植物和药用植物广为种植，由于种植密度增加，病原菌积累，外界环境恶化等诸多因素的影响，狭叶十大功劳病害日益严重，部分病害已严重影响到其在医药和绿化事业的价值。据初步调查，四川发生严重的病害主要为白粉病和炭疽病，目前对狭叶十大功劳白粉病的报道较多[1，46]，而对炭疽病，国外仅见意大利有荷花炭疽菌Colletotrichum nymphaeae引起冬青叶十大功劳炭疽病的报道[7]，国内仅在广西有胶孢炭疽菌C. gloeosporioides引起阔叶十大功劳炭疽病的报道[8]，而狭叶十大功劳炭疽病的病原菌国内外目前未见系统报道。

狭叶十大功劳炭疽病主要危害植株完全展开的叶片，受害叶片最初出现凹陷小斑点，随后扩展成近圆形、椭圆形或不规则形，病斑中部灰白色至灰褐色，稍微凹陷，边缘黑褐色或暗紫色，具黄色晕圈，条件适宜时，病斑上形成许多黑色的小粒点（病原菌的分生孢子盘），发病严重时叶片枯死，影响植株的生长。目前四川省狭叶十大功劳炭疽病发生范围虽不如白粉病广，但在局部地区危害较为严重，发病率可高达50%～60%。弄清病原菌的分类地位是病害防控的基础。而生物学特性在一定程度上反映了病原菌生长所需的条件，通过了解病原菌生长的条件，可根据环境条件，预测病害发生的情况，适时用药，减轻病害的发生发展。本研究对狭叶十大功劳炭疽病进行了病原鉴定和生物学特性研究，旨在弄清病原，掌握发病规律，从而为病害的防控提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

2015年9月，从四川省成都市采集疑似感染炭疽病的新鲜狭叶十大功劳病叶，一部分用于显微鉴定，一部分用于分离。

1.2 显微鉴定

选取疑似为炭疽病的新鲜狭叶十大功劳病叶，徒手切片后在显微镜下观察。

1.3 病原菌的分离与纯化

病原菌的分离采用常规的组织分离法[9]，经分离培养得到的菌株单孢纯化后于4℃冰箱中保存备用。

1.4 致病性测定

将保存的菌株在PDA培养基上活化后，接种于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基平板上，25℃培养7 d，洗下分生孢子，配制成浓度约为107个/mL的孢子悬浮液，用毛笔刷于健康的一年生狭叶十大功劳叶片表面。清洗除去表面的灰尘，再用75%的酒精棉球擦拭，无菌水清洗后自然晾干，设置穿刺与无伤两个处理，均以刷无菌水的叶片为对照，每处理接种10片叶，重复3次。回接后的叶片置于25℃光照培养箱中保湿培养，每天观察发病情况。若接种叶片发病则取发病部位重新分离，完成柯赫氏法则验证。

1.5 病原菌的鉴定

1.5.1 形态学鉴定

将病原菌移接于PDA平板上，25℃光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）条件下培养，观察和记录菌落形态和颜色。待病原菌产孢后，制成玻片观察分生孢子的形态，随机测量100个孢子的大小。采用玻片萌发法观察附着胞的形态，分生孢子附着胞的萌发参考Yang等[10]，菌丝附着胞的萌发参考Cai等[11]，分别在24 h和7 d后观察附着胞形成情况，各随机选取50个测量大小。

1.5.2 病原菌的多基因系统学鉴定

收集供试菌株的菌丝，采用生工生物工程股份有限公司（生工）研制的Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取病原菌DNA。参照Weir等人[12]的方法，由生工生物工程技术服务有限公司合成核糖体内转录间隔区（internal transcribed spacer， ITS）、肌动蛋白基因（actin gene， ACT）、3磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）、几丁质合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS1）、β微管蛋白基因（βtubulin gene，TUB2）和钙调蛋白基因（calmodulin gene，CAL）6对引物，反应体系及条件参照李沛利等[13]。

将获得的PCR产物送至生工生物工程科技服务有限公司测序，将所得各个基因序列与GenBank中的序列进行比对，并结合测序峰图进行必要手动修改。下载相似性高的序列及其对应复合种常见模式菌的序列（表1），使用ClustalX2.0.10软件进行剪切，按ITSACTGAPDHCHS1TUB2CAL的顺序相连，以C. karstii（CORCG6）为外群，通过PAUP v4.0b10软件以最大简约法（MP）构建系统发育树。

1.6 病原菌生物学特性研究

采用平板测定法。将供试菌株在PDA培养基平板上培养5 d，用打孔器（d=5 mm）在菌落外缘相同半径的圆周上打孔，制成菌丝圆片待用。生物学特性测定所用平板直径均为9 cm，每处理均重复3次。

1.6.1 不同温度、光照、pH对菌丝生长和产孢的影响

取菌丝圆片于自然pH的PDA培养基平板中央，分别置于0、5、10、15、20、25、30、35和40℃培养箱中黑暗培养，测定不同温度对菌丝生长和产孢的影响；置于光照、光暗交替、黑暗的25℃培养箱中培养，测定不同光照对菌丝生长和产孢的影响。取菌丝圆片于不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培养基平板中央，置于25℃培养箱中黑暗培养，测定不同pH对菌丝生长和产孢的影响。均用十字交叉法测定菌落直径，15 d后每皿平板中加入10 mL无菌水，将孢子充分洗下，用血球计数板计数。

1.6.2 不同碳、氮源对菌丝生长和产孢的影响

以不加蔗糖的查氏培养基[14]为基础培养基，分别加入与蔗糖等量的甘露醇、乳糖、麦芽糖、淀粉、果糖、葡萄糖和蔗糖，配制成不同的培养基，以不加碳源的查氏培养基为对照（CK）。以不加硝酸钠的查氏培养基为基础培养基，分别加入与硝酸钠等量的尿素、草氨酸、硫酸铵、硝酸钾、氯化铵、甘氨酸、蛋白胨和硝酸钠，配制成不同的培养基，以不加氮源的查氏培养基为对照（CK）。取菌丝圆片分别接于培养基平板中央，置于25℃恒温培养箱中黑暗培养，按照1.6.1的方法测定菌落直径和计算产孢量。

1.6.3 数据分析

通过SPSS 20.0软件，采用Duncan氏新复极差法[14]对数据进行单因素方差分析（P=0.05）。

2 结果与分析

2.1 显微鉴定

病部切片后，可观察到分生孢子盘半埋生在寄主组织下，具黑褐色刚毛，分生孢子单孢，圆柱形（图1）。

2.2 菌株的分离培养

经分离培养得到的菌株菌落形态基本一致，将单孢纯化后得到代表菌株命名为SDGL3用于进一步测定。

2.3 病原菌的致病性

将SDGL3的孢子悬浮液回接到健康的十大功劳叶片上7 d后，穿刺接种的狭叶十大功劳叶片全部发病（图2），症状与田间观察到的相似（图3），对照和无伤接种的处理不发病；用发病的病斑进行常规分离，再次获得与原分离菌一致的病原菌，根据柯赫氏法则，证明接种菌即为狭叶十大功劳炭疽病的病原菌。

2.4 病原菌的形态学鉴定

在PDA培養基上培养，菌落正面菌丝稠密，棉絮状，初为白色后转为灰白色或鼠灰色（图4a），背面为黄褐色，略带轮纹（图4b），菌丝生长速率为12.6 mm/d，培养第7天菌落中央伴有粉红色孢子堆产生。分生孢子无色，单胞，长椭圆形，两端钝圆，具1～2个油球（图4c），随机选取100个分生孢子进行测量，得其大小为（8.8～16.0）μm×（3.1～5.6）μm（平均12.7 μm×4.6 μm，n=100）。分生孢子附着胞椭圆形、棒形或不规则形（图5），大小为（6.7～15.2）μm×（5.2～8.2）μm （平均10.3 μm×6.5 μm，n=50）。菌丝附着胞圆形、卵形、棒形或不规则形（图6），大小为（5.0～14.2）μm×（4.4～8.9）μm，（平均10.1 μm×6.4 μm，n=50）。根据病原菌的形态特征，结合Weir等人[12]的描述，初步确定狭叶十大功劳炭疽病的病原菌SDGL3属于胶孢炭疽复合种（C.gloeosporioides species complex）。

2.5 病原菌的多基因系统学鉴定

构建的多基因系统发育树树长TL=857，一致性指数CI=0.833 1，保留指数RI=0.798 3，校正一致性指数RC=0.665 1，从发育树上（图7）可以看出，SDGL3菌株与果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成一个明显的分支，而其他种的炭疽菌也各自聚在一起形成明显的分支，并且每个分支之间都有较高的支持率，因此，确定狭叶十大功劳炭疽病的病原菌为果生炭疽菌C.fructicola Prihastuti，L.Cai & K.D.Hyde。

2.6 病原菌生物学特性研究

2.6.1 不同温度、光照、pH对菌丝生长和产孢的影响

SDGL3对温度的适应范围较广，在温度10～35℃之间均能生长和产孢，最适生长和产孢温度均为30℃。光照对SDGL3的菌丝生长和产孢无明显影响，但对菌落颜色有影响，菌落在光照条件下为白色，光暗交替条件下为鼠灰色，黑暗条件下为墨绿色。SDGL3对pH的适应范围较广，菌丝在pH为3～11之间均能生长和产孢，菌丝生长最适pH为7，产孢最适pH为4（图8）。

2.6.2 不同碳、氮源对菌丝生长和产孢的影响

SDGL3在供试的8种培养基上均能生长和产孢，在葡萄糖、甘露醇、乳糖、麦芽糖为碳源的培养基中菌丝生长较快，在不加碳源的CK中菌丝生长最慢且菌丝非常稀疏，但菌落大小与在果糖、淀粉、蔗糖为碳源的培养基中差异不显著。在碳源为麦芽糖时产孢最多，极显著高于其他碳源，在未加碳源的CK中产孢最差，极显著低于其他碳源。SDGL3在供试的9种不同氮源培养基上均能生长和产孢，在以蛋白胨为氮源的培养基中生长最快，产孢最多，极显著高于其他氮源。在尿素为氮源的培养基中生长最慢，产孢也最少。在不加氮源的CK中菌丝生长较快，仅次于氮源为蛋白胨和甘氨酸时，但菌丝非常稀疏，产孢量少，与氮源为尿素、草氨酸时差异不显著，极显著低于其他氮源（图8）。

3 结论与讨论

本文将引起狭叶十大功劳炭疽病的病原菌鉴定为果生炭疽菌C. fructicola，研究结果与同属的冬青叶十大功劳和阔叶十大功劳炭疽病的病原不尽相同[78]。究其原因，一方面可能是由于一种寄主植物本身可被多种炭疽菌所侵染，如鹅掌柴可被喀斯特炭疽菌C. karstii和暹罗炭疽菌C. siamense所侵染[13]，芒果可被亚洲炭疽菌C. asianum、果生炭疽菌C. fructicola和喀斯特炭疽菌C. karstii等5种炭疽菌所侵染[15]，辣椒可被胶孢炭疽菌C. gloeosporioides、暹罗炭疽菌C. siamense、 果生炭疽菌C. fructicola等 7种炭疽菌侵染[16]。另一方面，果生炭疽菌C.fructicola所属的胶孢炭疽复合种C.gloeosporioides species complex，在形态鉴定的基础上，需选用多基因联合进行鉴定，才能准确鉴定到种，谭海文等[8]只用了ITS序列进行了鉴定，该序列不能很好地区分胶孢炭疽复合种（C.gloeosporioides species complex）里面的近缘种[12]，因此得出的结果还需选用其他引物进行进一步的鉴定。本文采用组织分离法分离病原菌，单孢纯化后通过柯赫氏法则验证为致病菌；根据形态学特征，结合ITS、ACT、GAPDH、CHS1、TUB2和CAL进行多基因系统学分析，结果应该是准确可靠的，这是关于果生炭疽菌C. fructicola引起狭叶十大功劳炭疽病的首次报道，病原的确定为狭叶十大功劳炭疽病的诊断和防治提供了一定的理论依据。但狭叶十大功劳炭疽病的病原菌是否还有其他种类，则还有待于通过扩大采样范围，增加采样数量进一步确定。

果生炭疽菌C. fructicola在泰国的咖啡浆果上发现后[17]，相继在全球多种寄主植物上被发现，被证明具有广泛的寄主范围和地理分布[18]，不同寄主和地理来源的病原菌生活习性可能会有所不同，本文较为系统地研究了温度、光照、pH、碳源、氮源等不同条件对狭叶十大功勞炭疽菌SDGL3菌丝生长、孢子产生的影响，结果表明，SDGL3在10～35℃条件下均能生长和产孢，最适合菌丝生长和产孢的温度为30℃，这与狭叶十大功劳炭疽病8-9月为发病高峰相符；不同的光照条件对菌丝生长和产孢影响差异不显著，这可能是因为狭叶十大功劳喜阴，常栽种于大树下，所以病原菌对光不敏感；病原菌菌丝生长最适pH为7，产孢最适pH为4，说明病原菌孢子嗜酸，这可能与狭叶十大功劳喜排水良好的酸性腐殖土有关；不加碳源的CK菌丝生长最慢，产孢最差，说明碳源在SDGL3菌丝生长和产孢中起着重要作用。不加氮源的CK菌丝生长较快，产孢较少，说明氮源主要影响产孢。目前关于果生炭疽菌C. fructicola生物学特性的报道不多，仅见刘倩丽等人[19] 对引起檀香炭疽病的果生炭疽菌C. fructicola菌丝生长和孢子萌发的条件进行了研究，对比菌丝生长条件发现：两菌对温度、光照、pH、营养条件都有较好的适应性，最适温度一致，但最适光照、pH、碳源、氮源都有差异，这种差异可能与菌株在不同种类植物上寄生或者变异有关[20]。本研究明确了引起十大功劳炭疽病的果生炭疽菌C. fructicola菌丝生长及孢子产生的最适条件，为掌握病害发生发展规律，从而防治狭叶十大功劳炭疽病奠定了基础。

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（责任编辑：田 喆）