杨修镇，陈 玲，尹伶灵，刘少宁，牛华星，张呈军

(1.山东省兽药质量检验所，山东省畜产品质量安全监测与风险评估重点实验室，济南 250022)

阿维菌素粉收载于《兽药国家标准》(化学药品、中药卷)第一册，为兽用杀虫、杀螨剂，通过促进r-氨基丁酸(GABA)释放，增强神经膜对CI-通透性，阻断神经信号传递，使肌肉细胞失去收缩能力而致虫体死亡，对寄生于动物体内的线虫和节肢动物有极强的驱杀作用[1]。非泼罗尼(fipronil)是一种新型高效杀虫剂，有触杀、胃毒及内吸作用，对跳蚤、螨、鳞翅目、同翅目、半翅目等害虫有效，但环境毒理学发现其对生态环境具有潜在的危险性[2]，我国于2009年10月起禁用于农业和畜牧业。2017年8月初，荷兰爆出“毒鸡蛋”事件，鸡蛋受杀虫剂非泼罗尼大范围污染，持续发酵的欧洲“毒鸡蛋”事件影响欧洲多国。阿维菌素粉是畜牧业临床应用广泛的驱虫药，部分养殖场夏季常用于防治蝇蛆，为防止不法厂家为增强阿维菌素粉的效果在其中添加非泼罗尼给畜禽产品带来安全隐患，农业部紧急发布了2571号公告[3]，公布了兽药中非法添加非泼罗尼检查方法标准。该标准主要适用于阿维菌素粉，采用高效液相色谱法测定，紫外光谱匹配定性。目前尚无采用液相色谱-串联质谱法测定阿维菌素粉中非法添加非泼罗尼的报道。

1 仪器与材料

Waters Xevo TQ-S高效液相-串联质谱仪；电子天平(感量0.01 g、 0.00001 g)；非泼罗尼对照品，批号20170328，含量98.5%，国家标准物质中心；阿维菌素粉(批号20170301，山东天宇生物科技有限公司提供)。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 液相色谱条件 色谱柱为C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流动相A：水；流动相B：乙腈；流速0.2 mL/min；进样量2 μL；柱温35 ℃。液相色谱梯度洗脱程序见表1。

表1 液相色谱梯度洗脱程序Tab 1 HPLC Gradient Elution

2.2 质谱条件 根据参考文献[4]方法，电喷雾离子源；负离子扫描(ESI-)；多反应监测(MRM)；离子源温度：150 ℃；脱溶剂温度：400 ℃；脱溶剂氮气流速：900 L/h；毛细管电压：3 kV；测试药物定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量经调谐确定，具体见表2。

表2 定性、定量离子对及对应的锥孔电压和碰撞能量Tab 2 The qualitative and quantitative ion pair and the corresponding cone voltage and collision energy

2.3 溶液的制备

2.3.1 对照品溶液制备 精密称取非泼罗尼照品25 mg置25 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg/mL的非泼罗尼对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液，加20%乙腈水溶液逐级稀释成5 ng/mL的非泼罗尼对照品溶液，即得。

2.3.2 供试品溶液制备 称取阿维菌素粉约1.0 g，精密称定，置200 mL容量瓶中，加乙腈约150 mL，振摇5 min，加乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液1 mL置100 mL容量瓶中，加20%乙腈稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置100 mL容量瓶中，加20%乙腈稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。

2.3.3 阴性样品溶液制备 取不含非泼罗尼的阿维菌素粉(批号20170301，山东天宇生物科技有限公司提供)，按供试品溶液制备方法制备阴性样品溶液。

2.3.4 阳性样品溶液制备 取不含非泼罗尼的阿维菌素粉(批号20170301，山东天宇生物科技有限公司提供)，每1 g添加非泼罗尼10 mg后，按供试品溶液制备方法制备阳性样品溶液。

2.4 专属性试验 精密吸取对照品溶液、阳性样品溶液、阴性样品溶液各2 μL，注入液相色谱-串联质谱仪，在上述液相色谱条件和质谱条件下进行测定，阳性样品溶液色谱中在与对照品色谱相应的位置出相同的峰，阴性样品无干扰，结果见图1～图3。

图1 非泼罗尼对照品溶液色谱图Fig 1 Chromatographic trace of fipronil standard solution

图2 阳性样品溶液色谱图Fig 2 Chromatographic trace of positive sample solution

图3 阴性样品溶液色谱图Fig 3 Chromatographic trace of negative sample solution

2.5 线性关系考察 精密量取非泼罗尼对照品贮备液，用20%乙腈水溶液逐级稀释成0.025、0.05、0.5、5、10、20 ng/mL的系列溶液，注入液相色谱-串联质谱仪，在上述液相色谱条件和质谱条件下进行测定，以定量离子峰面积(y)为纵坐标，浓度为横坐标(x，ng/mL)，进行线性回归分析。回归方程为：y=53349x-6170.7(r2=0.9995)，结果表明非泼罗尼进样浓度在0.025～20 ng/mL范围内与定量离子峰面积呈良好的线性关系。

2.6 基质效应试验 精密量取非泼罗对照品贮备液，用阴性样品溶液逐级稀释成0.025、0.05、0.5、5、10、20 ng/mL的系列溶液，注入液相色谱-串联质谱仪，在上述液相色谱条件和质谱条件下进行测定，与线性关系考察项相应浓度所得的色谱图进行比较，相对偏差均小于3%，说明阿维菌素粉基质不会对非泼罗尼产生显著的影响，故采用直接外标法定量。

2.7 检出限与定量限 取不含非泼罗尼的阿维菌素粉(批号20170301，山东天宇生物科技有限公司提供)，添加一定量非泼罗尼，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，在上述液相色谱条件和质谱条件下进行测定。满足欧盟657号决议[5]规定的定性条件的最低添加量为本方法的检出限，大于检出限且定量离子色谱峰的信噪比(S/N)满足在10∶1以上，并且回收率满足80%～120%之间的最低添加量为本方法的定量限[6]。本方法的检出限为0.04 mg/g，定量限为0.1 mg/g。

2.8 精密度与回收率试验 取不含非泼罗尼的阿维菌素粉(批号20170301，山东天宇生物科技有限公司提供)，每1 g分别添加非泼罗尼0.1、1、30 mg(低量添加系采用加入一定量的对照品贮备液来实现，例如每1 g用移液器加入100 μL的1 mg/mL的非泼罗尼对照品贮备液来实现0.1 mg/g添加 )，各平行5份，按供试品溶液制备方法制备样品溶液，分别注入液相色谱-串联质谱仪，在上述液相色谱条件和质谱条件下进行测定，0.1、1、30 mg/g三个添加水平下，回收率在84.6%～112.6%之间，相对标准偏差为1.0%～7.7%。，结果见表3。

表3 精密度与回收率试验Tab 3 Precision and recovery test

2.9 供试品溶液稳定性试验 取同一阳性样品溶液，于制备后0、2、4、6、12、24、48 h注入液相色谱-串联质谱仪，在上述液相色谱条件和质谱条件下进行测定，非泼罗尼含量的RSD为4.2%，表明样品溶液在48 h内稳定。

2.10 50批样品检测结果 对从兽药GSP经营部随机购买的50批阿维菌素粉按照本研究建立的方法进行检测，结果均未检出非泼罗尼。

3 讨论与小结

目前家禽养殖场环境一般较差，粪便尚未完全做到无害化处理[7]，夏季蝇蛆滋生产生的传染病严重影响了经济效益。应将养殖场粪便及时清理，采用密封发酵处理等措施减少蝇蛆繁殖，而不是大量使用兽药来控制蝇蛆。兽药的大量使用除增加成本外，还会致使畜禽产品残留量超标危害食品安全。

我国已发布的其他标准中，农产品中非泼罗尼的残留检测较为常见，例如SN/T 4039-2014出口食品中萘乙酰胺、吡草醚、乙虫腈、氟虫腈残留量的测定方法液相色谱-质谱/质谱法，采用了乙腈提取、HLB固相萃取柱净化的方法。阿维菌素粉中非法添加非泼罗尼是以治疗为目地的，添加量较大，因此，参照农业部公告第2571号公布的兽药中非法添加非泼罗尼检查方法采取了直接溶解稀释法。

农业部公告第2571号公布的兽药中非法添加非泼罗尼检查方法采用紫外光谱匹配定性，物质的紫外吸收光谱是其分子中生色团及助色团的特征，而不是整个分子的特征，如果物质组成的变化不影响生色团和助色团，就不会显著地影响其紫外吸收光谱[8]。本方法采用串联质谱的两对离子定性，大大排除了假阳性的可能，定性更为准确。非泼罗尼化学结构中含有-NH2等电负性较强的基团，易于失去H得到负离子峰，因此，采用负离子扫描(ESI-)模式。仪器在由正离子模式向负离子模式切换时应对系统进行足够的平衡，少量甲酸的存在会严重影响离子化，必要时可对插入流动相的管线及吸头先进行清洗。非泼罗尼极性较小，在色谱柱上保留较强，如果采用水-甲醇为流动相进行梯度洗脱，分析时间较长，乙腈洗脱能力强，黏度较小，可有效降低色谱系统压力，且在实际分析中能够获得良好的峰形，故采用水-乙腈为流动相进行梯度洗脱。

阿维菌素粉基质较为简单，基质效应试验证明基质不会对非泼罗尼产生显著的影响，因此，采用了直接外标定量的方法，且各添加浓度回收率能处于80%～120%之间，满足定量要求。

从兽药GSP经营部随机购买的50批阿维菌素粉均未检出非泼罗尼，这与农业部实施《兽医兽药经营质量管理规范》和以兽药“二维码”标识为核心的兽药追溯监管工作有关。目前有些养殖场通过互联网和物流渠道购买兽药，兽药管理部门难以对这种渠道的兽药进行有效监管，应加大这种兽药的检查力度。

本试验建立的阿维菌素粉中非法添加非泼罗尼检查方法简便、准确、快速、灵敏，适用于阿维菌素粉中非法添加非泼罗尼的检测。

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