★刘新辉 孔小强 胡鹏翼 赵准 沈汉福 吴建明 刘秀娟 廖正根 朱金华 高书亮 余日跃,3**（.江西中医药大学 南昌 330004；.浙江维康药业股份有限公司 浙江 丽水33000；3.江西省中药药理学重点实验室 南昌 330004）

口腔溃疡（oral ulcer）是口腔黏膜病中最常见的疾病，患病率高达20%左右，居口腔粘膜病的首位。主要表现为口腔粘膜反复出现孤立的、圆形或椭圆形的溃疡，溃疡表浅，呈淡黄色，或白色，边缘整齐，周围绕以红晕，可单发或多发，有明显的灼痛。发病不受年龄限制，以青年为多，女性略多于男性，一年四季均能发生，冬春季较多。动物模型的建立是研究疾病病因、机制及治疗等的重要手段，国内外对口腔溃疡动物模型的建立做了大量的研究和论证［1］。口腔溃疡模型的建立方法多样，本实验采用细菌感染诱导法和化学物质灼烧法。

1 材料

1.1 动物 日本大耳兔（南昌龙平兔业有限公司，许可证号scxk（赣）2014-0005），雌雄兼用，体重2kg左右。

1.2 设备 包埋机（EG1150，徕卡公司）；切片机（RM2235，徕卡公司）；倒置荧光显微镜（IBE2000，徕卡公司）；内窥镜等。

1.3 试药与试剂 银黄滴丸制剂前提取的金银花提取物和黄芩提取物（浙江维康药业股份有限公司提供，批号：B160505）。栀子金花丸（天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药，批号：C145065）。金黄色葡萄球菌ATCC25923（江西省临床检验中心）、苯酚溶液。

2 方法

2.1 药液配制

2.1.1 供试液 银黄滴丸制剂提取物（金银花∶黄芩=5∶2）成人临床剂量为24mg/kg，按体表面积折算家兔剂量为78.4mg/kg。拟设家兔的低、中、高剂量分别为78.4、156.8和313.6mg/kg。栀子金花丸为阳性药，家兔剂量为420.43mg/kg。各药液均用蒸溜水配成10mL/kg的混悬液，常温保存，用前摇匀。

2.1.2 金黄色葡萄球菌溶液 取得金黄色葡萄球初始浓度为8.17×108cfu/mL，加生理盐水稀释至2.17×103cfu/mL，4℃冰箱储存，备用。

2.2 口腔溃疡的制备

2.2.1 感染性口腔溃疡 取家兔48只，体重为2～3kg，雌雄各半，取40只家兔在其下牙床后部用镊子造成黏膜20mm2左右的创伤，再用滴管滴一滴浓度为2.17×103cfu/mL的金黄色葡萄球菌溶液于创面，每日用沾有金黄色葡萄球菌溶液的镊子刺激创面一次，连续3天，创面出现溃疡面（白色或淡黄色假膜覆盖）［2］，并用内窥镜拍照，记录溃疡面大小。其余8只家兔为空白对照。

2.2.2 化学物质灼伤口腔溃疡 另取家兔36只，体重为2～3kg，雌雄各半，从中取30只家兔造模，将一小棉球置于直径为5mm的玻璃管一端（使之与管口平齐），再将玻璃管塞棉球一端蘸900g/L苯酚溶液，灼烧家兔左侧面颊60s，24h后观察，家兔口腔黏膜上均出现直径5mm的溃疡面［3］。内窥镜拍照，记录溃疡面大小。其余6只家兔为空白对照。

2.3 给药与观察 40只感染性口腔溃疡家兔，随机分为5组，分别为阳性药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和模型组。另8只未造模为空白组。每组家兔按相应剂量灌胃，给药体积为10mL/kg，每天给药一次，连续3天，模型组和空白组给相应的蒸溜水。30只苯酚灼伤口腔溃疡家兔，随机均匀分为5组，分别为阳性药组、低剂量组、中剂量组、高剂量组和模型组。另6只未造模为空白组。给药方法同2.3，连续给药6天。家兔给药前拍照其溃疡面，记录其大小。治愈率%=（给药前面积-给药后面积/给面药前面积）%。

2.4 病理观察 给药末次24h后处死家兔，剪取家兔溃疡组织，生理盐水洗净组织，空白组同理操作。并分装放入10%的中性甲醛中固定48h左右，分组，编号。组织进行脱水、浸蜡、包埋，以4μm厚度组织横断面切片，常规HE染色，组织封片，倒置荧光显微镜拍照观察，记录结果。

2.5 统计学方法 实验数据采用SPSS20.0软件处理，数据均以均数±标准差表示，采用单因素方差分析比较组间差异，P＜0.05有统计学差异。

3 结果

3.1 银黄滴制剂提取物对家兔口腔溃疡假膜的治疗作用 对内窥镜照片进行肉眼观察，给药前，各组家兔均在口腔破溃处有一块面积较大的白色或淡黄色的假膜，说明口腔溃疡形成并非常明显；与给药第3天或第6天比较，除模型组外，其余各组家兔给药后口腔溃疡均出现一定的愈合，呈现显著的药效，而模型组有轻微的愈合。

3.2 银黄滴丸制剂提取物对家兔口腔溃疡面积的愈合作用 通过PS软件对上述2.5内窥镜照片进行治愈面积计算，从造模成功后开始拍照记录到给药结束，治疗过程中溃疡恢复的程度，即为治愈率。分别计算金黄色葡萄球菌所致的口腔溃疡治治愈率和化学物质灼伤所致的口腔溃疡治治愈率，结果见表1和表2。

表1 银黄滴丸制剂提取物对金黄色葡萄球菌所致的口腔溃疡治愈率（，n=8）

表1 银黄滴丸制剂提取物对金黄色葡萄球菌所致的口腔溃疡治愈率（，n=8）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 给药前面积/mm2给药后面积/mm2 治愈率/%空白组 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型组 19.58 ±2.67 13.44 ±2.9 31.16 ±13.18阳性药组 19.44 ±6.84 2.52 ±0.79** 84.53±7.53**低剂量组 19.56 ±8.45 8.19 ±2.62* 31.16 ±13.18*中剂量组 19.54 ±9.73 6.97 ±5.52** 67.98±21.38**高剂量组 20.17 ±22.00 5.37 ±3.85** 77.13±19.46**

表2 银黄滴丸制剂提取物对化学物质灼伤所致的口腔溃疡治愈率（，n=6）

表2 银黄滴丸制剂提取物对化学物质灼伤所致的口腔溃疡治愈率（，n=6）

注：与模型组相比，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 给药前面积/mm2给药后面积/mm2 治愈率/%空白组 0.00±0.00 0.00±0.00** 0.00±0.00**模型组 7.53±1.05 5.80±1.43 31.16 ±13.18阳性药组 7.39±1.04 3.62±1.14* 84.53±7.53**低剂量组 7.68±1.55 4.01±0.93* 31.16 ±13.18*中剂量组 7.43±1.56 2.96±0.93** 67.98±21.38**高剂量组 7.45±1.89 3.40±1.56* 77.13±19.46**

3.3 组织病理学

3.3.1 银黄滴丸制剂提取物对金黄色葡萄球菌所致家兔口腔溃疡病理学影响 显微镜下放大10倍物镜，观察各组家兔溃疡组织病理变化。结果表明，模型组上皮组织结构不清晰，有变性、坏死、缺失，粘膜表面有炎性分泌物，并有血痂形成，粘膜下局部有充血、水肿及炎性细胞浸润。与模型组比较，阳性药组个别家兔局部皮下有充血现象；空白组无明显病理性改变；低、中、高剂量组上皮有局部变性、坏死，粘膜下局部有充血、炎性细胞浸润。结果见图1。

3.3.2 银黄滴丸制剂提取物对化学物质灼伤所致家兔口腔溃疡病理学影响 显微镜下放大10倍物镜，观察各组家兔溃疡组织病理变化。结果表明，模型组粘膜层损伤明显，上皮细胞脱落缺损，局部有细胞变性、坏死等病理性改变，粘膜及粘膜下可见充血、炎性细胞浸润。与模型组比较，阳性药组病理性损伤明显减轻，上皮组织无明显坏死；空白组组织结构正常，粘膜层完整无损；低、中、高剂量组病理性损伤减轻，上皮组织可见局部变性、坏死，局部粘膜下有充血及炎性细胞浸润。结果见图2。

图1 银黄滴丸制剂提取物对金黄色葡萄球菌所致家兔口腔溃疡病理学影响

图2 银黄滴丸制剂提取物对化学物质灼伤所致家兔口腔溃疡病理学影响

4 讨论

口腔溃疡（oral ulcers）俗称“口疮”，常见的发生于口腔黏膜的溃疡性损伤病症，多见于唇内侧、颊黏膜、前庭沟、软腭等部位，这些部位的黏膜缺乏角质化层或角化较差，从而易引起口腔溃疡［3］。

银黄滴丸制剂提取物的主要成分为金银花和黄芩。金银花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的干燥花蕾或带初开的花。夏初花开放前采收，干燥。具有清热解毒，疏散风热功能。主治痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热［4］。赵良忠等［5］研究表明，金银花提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌、青霉、黄曲霉、黑曲霉有一定的一致作用，并研究表明，加热处理可强化金银花提取物的抑菌效果，确定了最佳工艺条件，金银花提取物抑菌作用更为明显。Lee等［6］证实了金银花中的两个单体化合物Loniceroside A和Lonicerin具有显著的抗炎止痛作用。

黄芩为唇形科植物黄芩Scutellariabaicalensis Georgi的干燥根。春、秋二季采挖，除去须根和泥沙，晒后撞去粗皮，晒干。具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎功能，主治血热吐衄，痈肿疮毒等［7］。Li等［8］将黄芩应用于体外抗菌试验，结果表明，黄芩对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌等多种细菌均有一定的抑制作用。李倩楠等［9］研究表明，黄芩苷对发热大鼠具有解热作用，观察药后各组体温变化率与IL-6、IL-1、βTNF-α含量变化率作相关性分析，结果表明黄芩苷有显著的解热作用，七解热机制与TNF-α和IL-1β的含量减少密切的有关。

因此本实验结合金银花和黄芩的药理作用对两者联合用药，实验表明，银黄滴丸制剂提取物对金黄色葡萄球菌所致家兔口腔溃疡有明显的治疗作用。另一部分，虽两药在化学物质灼伤所致家兔口腔溃疡方面报道甚少，但通过实验表明，银黄滴丸制剂提取物对化学物质灼伤所致家兔口腔溃疡也有明显的治疗作用。而在机制作用方面，根据Xiao Y等研究表明，Jinkoubao能大大改善家兔口腔症状并兔并促进其愈合，作者认为这可能是通过调节表皮生长因子水平，加强口腔溃疡的修复能力［10］。本实验仅银黄滴丸制剂提取物对家兔进行形态学研究和药效学研究，其在机制方面的作用有待进一步探究。

参考文献

［1］Seko K, Kagami H, Senga K, et al. Effects of ovariectomy and estrogen replacement on rat oral mucosa [J]. Maturitas, 2005, 50(1):44-51.

［2］田景振,王静.冰硼贴片的药理作用及对动物口腔正常粘膜影响的研究[J]. 山东中医药大学学报, 1995(2):79-80．

［3］朱萱萱,王广基,刘建平,等.口腔膜治疗实验性大鼠口腔溃疡作用机理研究[J]. 中华中医药学刊, 2003, 21(1):84-85.

［4］国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京:中国医药科技出版社, 2015:221．

［5］赵良忠,蒋贤育,段林东,等. 金银花水溶性抗菌物质的提取及其抑菌效果研究[J]. 中国生物制品学杂志, 2006, 19(2):201-203.

［6］Lee SJ. Anitrinflammatoryactivity of the major constituents of Lonicerajaponical [J]. Arch Pharm Res, 1995, 18(2):133-135.

［7］国家药典委员会.中华人民共和国药典·一部[S].北京:中国医药科技出版社, 2010:283.

［8］Li Y C, Shen J D, Li J, et al. Chronic treatment with baicalin prevents the chronic mild stress-induced depressive-like behavior: involving the inhibition of cyclooxygenase-2 in rat brain [J]. Progress in Neuropsychopharmacology& Biological Psychiatry, 2013, 40(2):138-143.

［9］李倩楠,葛晓群.黄芩苷的解热作用及对细胞因子的影响[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(8):1 068-1 072.

［10］Xiao Y, Chen Q, Su S, et al. Effect of Jinkoubao on rabbit oral ulcer model [J]. Chongqing Medicine, 2017, 46(7):886-888.