郎玉苗,孙宝忠,马立新,张松山,谢 鹏,杨红茹,李 翠

(1.河北大学,河北保定 071002; 2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193)

蛋白质巯基亚硝基化(S-nitrosylation)是肉品科学领域中最新的研究热点之一。蛋白质巯基亚硝基化是指一氧化氮(NO·)共价结合到蛋白质半胱氨酸残基的巯基生成S-亚硝基半胱氨酸残基(S-nitrosocysteine,SNO)的过程[1],是一种典型的氧化还原依赖的蛋白翻译后修饰,影响蛋白质在细胞内的构象、活性和功能[2-3],且与衰老、肿瘤[4-5]、炎症[6-7]、肌营养不良[8]、阿尔茨海默病[9]、帕金森病[10]等人类疾病和健康密切相关[11]。然而,蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质影响的研究却很少。

鲜肉的品质可分为外观品质特性(如肉色、脂肪含量和分布、脂肪色、肉表面的汁液量、贮藏损失和质地)、食用品质特性(如嫩度、风味和多汁性)和信誉品质特性(如安全、营养、动物福利、道德伦理、原产地和产品商标或品牌等)。随着消费者生活水平的提高,消费者对高品质肉的需求逐渐增加,肉品加工企业应持续生产和提供高品质肉(美味、安全和健康)来确保肉品的持续消费[12]。已有研究表明,蛋白质巯基亚硝基化与肉品嫩度、肉色等肉品质有关[13],但相关研究却很少,其具体作用机制仍不明确。本文综述了蛋白质巯基亚硝基化的概念、分子机制及影响因素,并说明其对肉品品质的影响,为改善和提高肉品品质奠定理论基础。

1 蛋白质巯基亚硝基化概念

蛋白质巯基亚硝基化的概念是由Stamler于1994年首次提出,指一氧化氮(NO·)共价结合到蛋白质半胱氨酸残基的巯基生成S-亚硝基半胱氨酸残基(S-nitrosocysteine,SNO)的过程[4]。此后大量研究发现,巯基亚硝基化是一种重要的蛋白翻译后修饰,也是一种可逆的氧化还原反应,其影响蛋白质的结构,进而影响其功能和活性[2],在细胞信号转导调控中发挥重要作用[14]。与其它的蛋白翻译后修饰有所不同,蛋白质巯基亚硝基化既是一种信号通路调控机制,也可以通过翻译后修饰蛋白质来调控蛋白质功能而发挥作用[4]。Jain等[2]研究表明太阳花幼苗的巯基亚硝基化或去亚硝基化修饰作用是调控其盐胁迫应激的一种机制。Yang等[11]研究表明肥胖小鼠的肌醇需要蛋白-1(inostitol-requiring protein-1,IRE1α)的巯基亚硝基化程度增加了,被修饰的IRE1α能降低RNA酶活性。虽然蛋白质巯基亚硝基化修饰只是众多蛋白翻译后修饰中的一种,但其重要性不容忽视。然而,由于蛋白质巯基亚硝基化检测和亚硝基化位点的鉴定难度大,Swiss-Prot和TrEMBL数据库中有关蛋白质巯基亚硝基化的数据很少[5],而针对蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质的研究就更少[15]。因此,应加快蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质影响及机理的研究,为从蛋白质巯基亚硝基化角度改善肉品品质奠定理论基础。

2 蛋白质巯基亚硝基化的分子机制

2.1 蛋白质巯基亚硝基化的反应机理

2.2 一氧化氮合成酶活性及其影响因素

生物体内一氧化氮合成酶(nitric oxide synthase,NOS)有3个亚类,即神经型一氧化氮合成酶(neuronal NOS,nNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial NOS,eNOS)和诱导型一氧化氮合成酶(inducible NOS,iNOS)[19]。骨骼肌中以nNOS为主,nNOS通过与营养不良相关蛋白1-互养蛋白键合而附着在膜表面。骨骼肌中NO是精氨酸在NOS作用下转化为瓜氨酸的过程中产生的[20]。因NO具有脂溶性,其可以跨膜转导细胞信号,因此广泛参与心血管系统、免疫系统的生理和病理过程[5]。Brannan等[21]研究结果显示宰后24 h的猪隔膜中NOS仍有活性,并且NOS的活性在pH4.5～7.4是稳定的。Liu等[22]报道了宰后1 d猪背最长肌、腰大肌和半膜肌中均具有NOS活性,而宰后3 d半膜肌仍存在活性;NOS活性为半膜肌>背最长肌>腰大肌;NOS活性与IIA/X型肌纤维比例正相关,与IIB型肌纤维比例负相关。

NOS的表达量或活性受多种因素影响,nNOS的分布与物种和肌纤维有关，如人体中慢收缩型肌纤维中NOS的含量要比快收缩型肌纤维中多,而在老鼠肌肉中却有相反的表达模式。NOS的表达受底物浓度、辅助因子和蛋白修饰等多种因素调控。哺乳动物体内的精氨酸酶(L-arginine)病理性的升高会导致NO缺乏而使动物的蛋白质巯基亚硝基化水平降低,进而出现一些病理现象,如气道高反应性。然而,动物体内NO含量过高,会产生细胞毒性而引起细胞凋亡。NOS是一种氧化还原酶,其发挥作用需要氧、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide Phosphate,NADPH)、四氢蝶呤、黄素嘌呤单核苷酸和黄素嘌呤二核苷酸作为辅因子参与[23],这些辅助因子的浓度也会影响NOS的活性。eNOS和nNOS的活性受Ca2+、钙调蛋白浓度和活性的影响,体内Ca2+释放使Ca2+与钙调蛋白结合,从而激活NOS。此外,NOS的磷酸化也影响NOS的活性,nNOS被磷酸化后其酶活性降低[24]。由此可见,影响NOS活性的因素很多,可通过改变这些影响因素条件来调控NOS活性,进而调控蛋白质巯基亚硝基化修饰作用。

2.3 影响蛋白质巯基亚硝基化的因素

细胞内主要的NO供体是亚硝基谷胱甘肽,其可以将NO反式转移到蛋白质半胱氨酸巯基上,发生转亚硝基化作用。细胞内NO浓度、亚硝基谷胱甘肽浓度及蛋白质所处的氧化还原状态共同决定了蛋白质巯基亚硝基化修饰作用[25]。此外,蛋白质的空间结构及其修饰位点所处的微环境(如疏水性、pKa、Ca2+浓度和半胱氨酸的暴露特性等)均会影响蛋白质巯基亚硝基化作用[4,26-27]。影响蛋白质巯基亚硝基化修饰作用的因素很多,这可能也是蛋白质巯基亚硝基化机理仍不明确的原因之一。

3 蛋白质巯基亚硝基化与宰后成熟的关系

3.1 蛋白质巯基亚硝基化与宰后成熟相关蛋白酶

宰后成熟是提高肉品嫩度,整体改善肉品品质的重要措施之一。宰后成熟过程中肉品品质的改善主要是由于钙蛋白酶体系(calpain)、组织蛋白酶(cathepsin)、溶酶体(lysosome)和细胞凋亡酶(caspase)等肌肉内源酶系对骨骼肌骨架蛋白和肌原纤维蛋白的有限降解[13]。研究表明,钙蛋白酶的巯基亚硝基化修饰能活化钙离子通道、影响钙蛋白酶的活性[2]。μ-calpain是一种半胱氨酸蛋白酶,其在催化亚基部分含有11个半胱氨酸残基,在小亚基部分含有2个半胱氨酸残基。在pH5.5时钙蛋白酶与NO强化剂孵化时,80%的钙蛋白酶催化活性受到抑制[13]。μ-calpain活化位点半胱氨酸残基的巯基亚硝基化修饰能够影响其自溶解和蛋白水解活性,进而影响宰后成熟过程中肉品质变化[28]。Liu等[2]研究了试管中不同浓度亚硝基谷胱甘肽(S-Nitrosoglutathione,GSNO)对μ-calpain自溶解和催化活性的影响,结果显示蛋白质巯基亚硝基化负向调控μ-calpain活性;μ-calpain的半胱氨酸残基的催化基团的49、351、384和592位点以及小基团的142位点被巯基亚硝基化修饰。此外,蛋白质巯基亚硝基化修饰影响细胞凋亡酶的活性,caspase-3发生去硝基化会被激活,进而诱导细胞凋亡[29-31]。由此可见,蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质产生影响极有可能是通过调控宰后成熟相关酶活性(如调控钙离子通道、钙蛋白酶活性及细胞凋亡酶活性)来实现的。

3.2 蛋白质巯基亚硝基化与宰后糖酵解

动物宰后由于血液循环终止,肌细胞出现缺氧,能量代谢由有氧代谢转为无氧代谢(即糖酵解),此时糖原代谢为乳酸并在肌肉中蓄积,使宰后肌肉的pH下降[32]。而宰前应激状况、宰后肌肉温度和糖酵解相关酶活性均会影响宰后pH下降速率和终点pH,进而影响宰后成熟肉品质的形成。研究表明,蛋白质巯基亚硝基化对宰前糖代谢和宰后糖酵解有影响。Cottrell等[33]研究了注射L-NAME(NO合成抑制剂)组和运动组(刺激产生NO)的背最长肌和半膜肌宰后成熟过程中糖酵解变化,结果显示注射L-NAME改变了宰前羊的糖代谢,并且注射L-NAME抑制NO产生能增加宰后糖酵解。刘瑞等[15]研究结果显示，参与宰后糖酵解的酶均可被巯基亚硝基化修饰,其中亚硝基化修饰的甘油醛-3-磷酸脱氢酶和磷酸果糖激酶的活性会受到抑制。由此可见,蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质的影响极有可能与宰后糖酵解相关酶的巯基亚硝基化修饰有关。

4 蛋白质巯基亚硝基化与肉品品质的关系

4.1 蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质的影响

关于蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质的影响已有相关报道。Cook等[34]报道了宰后2 h注射NO促进剂和NO抑制剂到牛背最长肌中能够影响成熟2～6 d时的牛肉嫩度。Cottrell等[33]研究结果显示注射L-NAME能降低背最长肌的剪切力值,而对半膜肌的剪切力无影响,改善背最长肌的嫩度。Zhang等[35]研究了NO对宰后成熟过程中鸡胸肉的品质影响,其将实验分为对照组、NO合成抑制组(NOS)和NO加强组并在4 ℃成熟7 d,结果显示NO浓度影响冷藏保存中鸡胸肉的脂肪氧化、蛋白质氧化和品质特性。Li等[28]研究结果显示NOS抑制处理组的肌联蛋白和伴肌动蛋白的降解增加,蛋白质巯基亚硝基化影响宰后肌原纤维蛋白的降解。此外,蛋白质巯基亚硝基化可促进细胞生成热休克蛋白HSP70和HSP32。其中,肌肉中的HSP70的表达与嫩度有直接关系,HSP70的高表达能够延缓肌肉的嫩度[36]。以I型肌纤维为主的肌肉(腰大肌)和以II型肌纤维为主的肌肉(背最长肌)的蛋白质巯基亚硝基化存在差异[23]。由此可见,可以通过调控蛋白质巯基亚硝基化作用来改善肉品品质,特别是肉品嫩度。上述研究表明,蛋白质巯基亚硝基化不仅可以调控钙离子通道、钙蛋白酶活性及细胞凋亡酶活性,还能调控肌肉收缩、能量代谢和蛋白酶活性[33,35]。

4.2 蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质影响的潜在机制

大量研究表明,宰后能量代谢、钙离子释放、钙蛋白酶及细胞凋亡酶活性能影响宰后肌肉蛋白的降解,进而影响肉品品质的形成。Huang等[37]研究了注射Ca2+和Zn2+对宰后牛骨骼肌中caspase-3活性和嫩度的影响,结果显示Ca2+加快了宰后嫩化速率而Zn2+延缓了这一进程,同时Ca2+刺激了细胞色素C的释放并提高了caspase-3的活性。Smit等[38]研究结果显示高压处理能够抑制宰后糖酵解进而提高肉品品质。Santos等[39]研究了宰后早期pH下降和成熟对牛肉嫩度和持水力的影响,结果显示中等速率的糖酵解能降低背最长肌的剪切力值,快速糖酵解的肉品质最好。Choe等[40]研究了放血、宰后肌肉代谢与猪肉品质特性的关系,结果显示影响猪肉品质特性的主要因素是肌肉中通过宰后糖酵解产生的终点乳酸含量,血中葡萄糖和乳酸水平以及宰后肌肉中糖原和乳酸水平能够解释大部分的猪肉品质特性。Zhao等[41]研究了宰后7 d内鸡胸肉的品质特性、蛋白水解与钙蛋白酶的关系,结果显示宰后12 h内μ-calpain与猪肉品质特性和蛋白水解有强相关,宰后12 h～7 d μ-calpain在肉品质变化中起重要作用,而μ/m-calpain对蛋白水解和肉品质变化的影响较小。Biswas等[42]指出了calpain体系对宰后嫩化过程和肉品质的形成具有重要作用,并且最终嫩度的形成决定于内源性酶对关键肌原纤维蛋白的水解程度。

虽然关于蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质影响的研究越来越多,但其机理仍不清楚。通过对已有研究结果的分析可以初步推测蛋白质巯基亚硝基化对肉品品质的机理,即蛋白质巯基亚硝基化可调控宰后肌肉钙离子浓度、能量代谢和蛋白水解相关酶活性,进而影响宰后肌肉中肌原纤维蛋白的水解,最终影响肉品品质。

5 展望

近年来,对蛋白质巯基亚硝基化机理方面的研究越来越多,关于其对肉品质的影响也逐渐受到肉品科学专家的关注。由于蛋白质巯基亚硝基化影响因素多、调控网络复杂以及现有研究技术手段的限制,其作用机理仍有待进一步细致的研究。随着新技术、新方法的开发的利用,未来可采用一些高通量的技术(如蛋白质组学)进一步研究亚硝基化修饰的作用机制。蛋白质巯基亚硝基化可通过调节钙离子通道、蛋白水解相关酶活性、糖酵解等多种途径影响宰后肌肉中蛋白水解,进而影响肉品品质的形成。因此,对蛋白质巯基亚硝基化影响肉品品质作用机理的研究,要从多角度进行综合研究,为从蛋白质巯基亚硝基化角度改善肉品品质提供重要的理论依据。

[1]Tsikas D,Böhmer A. S-Transnitrosation reactions of hydrogen sulfide(H2S/HS-/S2-)with S-nitrosated cysteinyl thiols in phosphate buffer of pH7.4:Results and review of the literature[J]. Nitric Oxide,2017,65:22-36.

[2]Liu R,Li Y,Wang M,et al. Effect of protein S-nitrosylation on autolysis and catalytic ability of μ-calpain[J]. Food Chemistry,2016,213:470-477.

[3]Jain P,von Toerne C,Lindermayr C,et al. S-nitrosylation/denitrosylation as a regulatory mechanism of salt stress sensing in sunflower seedlings[J]. Physiologia Plantarum,2018,162(1):49-72.

[4]石婷,陈铭,陈雄平,等. 蛋白质巯基亚硝基化分子机制及其疾病相关性[J]. 化学进展,2015,27(5):594-600.

[5]梁娟. 蛋白质巯基亚硝基化反应机理的理论研究[D]. 上海:上海交通大学,2011.

[6]Foley T D,Koval K S,Olsen S H,et al. Protein S-nitrosylation:Possible links between psychophysiological stress and neurodegeneration[J]. Free Radical Biology and Medicine,2017,112:73-74.

[7]Yang L,Calay E S,Fan J,et al. S-Nitrosylation links obesity-associated inflammation to endoplasmic reticulum dysfunction[J].Science,2015,349(6247):500-506.

[8]Chung H S,Kim G E,Holewinski R J,et al. Transient receptor potential channel 6 regulates abnormal cardiac S-nitrosylation in Duchenne muscular dystrophy[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2017,29:E10763-E10771.

[9]Di Domenico F,Barone E,Perluigi M,et al. The triangle of death in Alzheimer’s disease brain:the aberrant cross-talk among energy metabolism,mammalian target of rapamycin signaling,and protein homeostasis revealed by redox proteomics[J]. Antioxidants & Redox Signaling,2017,26(8):364-387.

[10]Oh C K,Sultan A,Platzer J,et al. S-Nitrosylation of PINK1 attenuates PINK1/Parkin-dependent mitophagy in hiPSC-Based parkinson’s disease models[J]. Cell Reports,2017,21(8):2171-2182.

[11]Akhtar M W,Sanz-Blasco S,Dolatabadi N,et al. Elevated glucose and oligomericβ-amyloid disrupt synapses via a common pathway of aberrant protein S-nitrosylation[J]. Nature Communications,2016,7:10242.

[12]郎玉苗. 肌纤维类型对牛肉嫩度的影响机制研究[D]. 北京:中国农业科学院,2016.

[13]李玉品. 蛋白质亚硝基化对宰后猪肉钙蛋白酶系统和蛋白质降解的影响[D]. 南京:南京农业大学,2015.

[14]Lamotte O,Bertoldo J B,Besson-Bard A,et al. Protein S-nitrosylation:specificity and identification strategies in plants[J]. Frontiers in Chemistry,2015,2:114.

[15]刘瑞,周光宏,张万刚. 一氧化氮和蛋白质亚硝基化对鲜肉品质的影响研究进展[J]. 中国畜牧杂志,2017,53(4):1-2.

[16]Foster M W,McMahon T J,Stamler J S. S-nitrosylation in health and disease[J]. Trends in Molecular Medicine,2003,9(4):160-168.

[17]Kundu D,Abraham D,Black C M,et al. Reduced levels of S-nitrosothiols in plasma of patients with systemic sclerosis and Raynaud’s phenomenon[J]. Vascular Pharmacology,2014,63(3):178-181.

[18]Gow A J,Buerk D G,Ischiropoulos H. A novel reaction mechanism for the formation of S-nitrosothiolinvivo[J]. Journal of Biological Chemistry,1997,272(5):2841-2845.

[19]Du L,He F,Kuang L,et al. eNOS/iNOS and endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis in the placentas of patients with preeclampsia[J]. Journal of Human Hypertension,2017,31(1):49-55.

[20]Papuc C,Goran G V,Predescu C N,et al. Mechanisms of oxidative processes in meat and toxicity induced by postprandial degradation products:A review[J]. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2017,16(1):96-123.

[21]Brannan R G,Decker E A. Nitric oxide synthase activity in muscle foods[J]. Meat Science,2002,62(2):229-235.

[22]Liu R,Li Y,Zhang W,et al. Activity and expression of nitric oxide synthase in pork skeletal muscles[J]. Meat Science,2015,99:25-31.

[23]Zhang W. Involvement of protein degradation,calpain autolysis and protein nitrosylation in fresh meat quality during early postmortem refrigerated storage[D]. Iowa:Iowa State University,2009.

[24]黄波,陈畅. 一氧化氮的功能及其作用机制(I)——性质与功能[J]. 生物物理学报,2012,28(3):173-184.

[25]Tada Y,Spoel S H,Pajerowska-Mukhtar K,et al. Plant immunity requires conformational charges of NPR1 via S-nitrosylation and thioredoxins[J]. Science,2008,321(5891):952-956.

[26]Marino S M,Gladyshev V N. Structural analysis of cysteine S-nitrosylation:a modified acid-based motif and the emerging role of trans-nitrosylation[J]. Journal of Molecular Biology,2010,395(4):844-859.

[27]Doulias P T,Greene J L,Greco T M,et al. Structural profiling of endogenous S-nitrosocysteine residues reveals unique features that accommodate diverse mechanisms for protein S-nitrosylation[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences,2010,107(39):16958-16963.

[28]Li Y,Liu R,Zhang W,et al. Effect of nitric oxide on μ-calpain activation,protein proteolysis,and protein oxidation of pork during post-mortem aging[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(25):5972-5977.

[29]Nakamura T,Lipton S A. Aberrant nitric oxide signaling contributes to protein misfolding in neurodegenerative diseases via S-Nitrosylation and tyrosine nitration[M].Nitric Oxide(Third Edition),2017:373-384.

[30]Saligrama P T,Fortner K A,Secinaro M A,et al. IL-15 maintains T-cell survival via S-nitrosylation-mediated inhibition of caspase-3[J]. Cell Death & Differentiation,2014,21(6):904-914.

[31]Wu W,Wan O W,Chung K KK. S-nitrosylation of XIAP at Cys 213 of BIR2 domain impairs XIAP’s anti-caspase 3 activity and anti-apoptotic function[J]. Apoptosis,2015,20(4):491-499.

[32]Li Y J,Gao T,Li J L,et al. Effects of dietary starch types on early postmortem muscle energy metabolism in finishing pigs[J]. Meat Science,2017,133:204-209.

[33]Cottrell J J,McDonagh M B,Dunshea F R,et al. Inhibition of nitric oxide release pre-slaughter increases post-mortem glycolysis and improves tenderness in ovine muscles[J]. Meat Science,2008,80(2):511-521.

[34]Cook C J,Scott S M,Devine C E. Measurement of nitric oxide and the effect of enhancing or inhibiting it on tenderness changes of meat[J]. Meat Science,1998,48(1-2):85-89.

[35]Zhang W,Marwan A H,Samaraweera H,et al. Breast meat quality of broiler chickens can be affected by managing the level of nitric oxide[J]. Poultry Science,2013,92(11):3044-3049.

[36]Bjarnadóttir S G,Hollung K,Høy M,et al. Changes in protein abundance between tender and tough meat from bovine muscle assessed by isobaric Tag for Relative and Absolute Quantitation(iTRAQ)and 2-dimensional gel electrophoresis analysis[J]. Journal of Animal Science,2012,90(6):2035-2043.

[37]Huang F,Ding Z,Zhang C,et al. Effects of calcium and zinc ions injection on caspase-3 activation and tenderness in post-mortem beef skeletal muscles[J]. International Journal of Food Science & Technology,2017.

[38]Smit N R,Summerfield J W,Cannon J E. Use of high pressure processing to improve muscle quality by inhibiting post mortem glycolysis:U.S.,9713337[P]. 2017-7-25.

[39]Santos C,Moniz C,Roseiro C,et al. Effects of early post-mortem rate of pH fall and aging on tenderness and water holding capacity of meat from cull dairy holstein-friesian cows[J]. Journal of Food Research,2016,5(2):1.

[40]Choe J H,Choi M H,Ryu Y C,et al. Estimation of pork quality traits using exsanguination blood and postmortem muscle metabolites[J]. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2015,28(6):862.

[41]Zhao L,Xing T,Huang J,et al. Involvement of μ/m-calpain in the proteolysis and meat quality changes during postmortem storage of chicken breast muscle[J]. Animal Science Journal,2017. doi:10.1111/asj. 12921.

[42]Biswas A K,Tandon S,Giri A K,et al. Role of calpain system in post-mortem tenderization of meat and its influence on quality-A review[J]. Indian Journal of Poultry Science,2016,51(2):123-131.