王翰华,陈宏降,王 强,倪梦茜,3,阮洪生,*

(1.浙江医药高等专科学校,浙江宁波 315100; 2.宁波市中医院,浙江宁波 315010; 3.浙江中医药大学,浙江杭州 310053)

浙贝母(FritillariathunbergiiMiq.)为百合科植物,其干燥鳞茎是道地药材“浙八味”之首[1],有效成分是生物碱。前期研究表明,浙贝母花具有止咳化痰功效[2]。枇杷[Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.]为蔷薇科植物,其叶和花可作药用[3],枇杷花的有效成分是黄酮。宁海白枇杷是浙江省宁海县引进白沙枇杷,在独特的地方小气候环境中,优育的新品种[4]。浙贝母和宁海白枇杷都是宁波市特色经济作物。在生长过程中,它们的花大部分被打顶或疏掉,造成很大的浪费。中医理论而言,浙贝母味苦,性寒,归肺、心经,有清热散结,化痰止咳的功效,浙贝母花有止咳化痰功效[5];枇杷花味淡,微温,归肺经,有疏风止咳,通鼻窍的功效[6],浙贝母花与枇杷花配伍可发挥协同功效。

随着社会进步,人民生活水平的提高及生活节奏的加快,使得亚健康人群不断增加,人们对保健食品的需求越来越大,促使了保健饮料的高速发展同时也带来了巨大的挑战。保健饮料的发展已进入加速发展阶段,以中药为原料的功能饮料市场潜力巨大[7]。但目前,以止咳为卖点的保健饮料仍然较为缺乏。

前期研究表明,浙贝母花-宁海白枇杷花(4∶1)配伍时,能较好地协同发挥止咳化痰作用[8]。在此基础上,本文以浙贝母花和宁海白枇杷花为原料,研制一款色香味俱佳的新型复合保健饮料,并考察其止咳功效,以填补市场空白,并为浙贝母和宁海白枇杷的相关药用资源开发利用提供参考和依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

浙贝母花 浙贝母花采自宁波市海曙区龙观乡,经杨雄志教授鉴定为百合科浙贝母FritillariathunbergiiMiq.的花;宁海白枇杷花 采自宁海县一市镇,经杨雄志教授鉴定,为蔷薇科枇杷Eriobotryajaponica(Thumb.)Lindl.的花;贝母素乙对照品 中国食品药品检定研究院,批号110751-201110,含量以99.9%计;芦丁对照品 中国食品药品检定研究院,批号100080-201409,含量以92.6%计;蜜炼川贝枇杷膏 广州潘高寿药业股份有限公司,批号160118;木糖醇、柠檬酸、蜂蜜和果胶等 市售；SPF(无特定病原体)级小鼠(体质量20～25 g,雌雄各半)、豚鼠(雌雄兼用,体质量190～210 g) 由浙江大学实验动物中心提供,实验动物许可证号:SYXK(浙)2012-0178。

400A型小型粉碎机 永康云达冷风机厂;DZKW-D4电热恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器有限公司;RE-52型旋转蒸发仪 上海之信仪器有限公司;DSX-280A型高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂;WH-2000超声雾化器 广东粤华医疗器械厂有限公司;TU-1818型紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司;DR-M2型阿贝折光仪 ATAGO(爱拓)中国分公司;MP511 pH计 上海精密仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 生产工艺流程

1.2.2 操作要点 预处理:将浙贝母花与宁海白枇杷花分别进行除杂后粉碎。

提取:根据确定的浙贝母花与宁海白枇杷花提取工艺操作。

粗滤:布氏漏斗(单层滤纸)抽滤。

调配:在调配灌按配方比例(浙贝母花提取液160 g/L,宁海白枇杷花提取物40 g/L)将浙贝母花提取液、宁海白枇杷花提取液混合,再加入一定量的木糖醇、柠檬酸、蜂蜜和果胶,用搅拌器充分搅拌并加热40 min,过滤。

精滤:除去饮料中的细微颗粒及沉淀,使之澄清透明,再进行2次过滤。

灭菌:将成品放于高压灭菌锅中,条件为90 ℃,30 min,然后冷却至室温。

1.2.3 浙贝母花提取工艺

1.2.3.1 浙贝母花水提液的制备 取浙贝母花,粉碎,过4号筛,精密称取50 g,加一定量水,提取一定时间,重复一定次数,合并提取液,过滤并浓缩至100 mL,得浙贝母花水提液,测定水提液中总生物碱量(Y1,%)及浸膏得率(Y2,%)。

1.2.3.2 提取工艺设计 根据单因素预实验，以加水量(相对于浙贝母花质量)、提取时间及提取次数为考察因素，以总生物碱量、浸膏得率为指标(总生物碱量和浸膏得率的加权系数各为0.5)，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平设计见表1。采用综合加权评分法，以正交试验中总生物碱量和浸膏得率的最大值为100分，将各指标成分的总量分别转换为评分值，计算综合评分，再以综合评分计算正交试验结果，并进行方差分析，优选浙贝母花水提最佳工艺。

表1 浙贝母花正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments of Fritillaria thunbergii Miq. flower

1.2.2.3 总生物碱量和浸膏的测定 参考文献[9]制备供试品,以贝母素乙标准液为对照,413 nm处测定吸光度,由标准曲线(y=0.008+0.043x,r=0.9996)计算总生物碱含量。照2015年版《中国药典》浸出物测定法(通则2201)[10]项下方法测定,浸膏得率(%)=浸膏质量/供试品质量×100。

1.2.3 宁海白枇杷花提取工艺

1.2.3.1 宁海白枇杷花水提液的制备 取宁海白枇杷花,粉碎,过4号筛,精密称取50 g,加一定量水,提取一定时间,重复一定次数,合并提取液,过滤并浓缩至100 mL,得宁海白枇杷花水提液。测定提取液中总黄酮量(Y3，%)及浸膏得率(Y4，%)。

1.2.3.2 提取工艺设计 根据之前单因素预试验，以加水量、提取时间及提取次数为考察因素，以总黄酮量、浸膏得率为指标(黄酮量和浸膏得率的加权系数各为0.5)，选用L9(34)正交表进行试验，因素水平设计见表2。采用综合加权评分法，以总黄酮量和浸膏得率的9次试验的最大值为100分，将各指标成分的总量分别转换为评分值，计算综合评分值，再以综合评分值计算正交试验结果，并进行方差分析，优选宁海白枇杷花水提最佳工艺。

表2 宁海白枇杷花正交实验因素水平Table 2 Factors and levels of orthogonal experiments of Ninghaibai Loquat flower

1.2.3.3 总黄酮量和浸膏的测定 参考王翰华等[11]的方法配制供试品,以芦丁标准液为对照,510 nm处测定吸光度,由标准曲线(y=16.94x+0.004,r=0.9997)计算总黄酮量。照2015年版《中国药典》浸出物测定法(通则2201)[10]测定,浸膏得率(%)=浸膏质量/供试品质量×100。

1.2.4 饮料配方的优化 在之前单因素预实验基础上,以保健饮料的感官评分为评价指标[12-15](表3),应用统计学方法处理数据[16],对饮料配方进行正交实验优化,按正交表L9(34),设计正交实验,因素与水平见表4。

表4 配方正交实验因素水平Table 4 Factors and levels of orthogonal experiments of formula

1.2.5 质量指标检测 由之前的紫外分光光度法测定饮料中总生物碱和总黄酮含量;阿贝折光仪测定饮料中可溶性固形物含量[17];pH计测定饮料的酸碱度;按照GB/T 4789.2-2010和GB/T 4789.3-2010分别对饮料中菌落总数、大肠菌群及致病菌进行检测[18]。同时,在温度40 ℃,相对湿度75%的条件下储存3个月,考察稳定性。

1.2.6 药效学研究

1.2.6.1 小鼠氨水引咳实验 对昆明种小鼠进行预试[19],筛选出合格小鼠50只,雌雄各半。待小鼠稳定3 d后,随机分为5组,每组10只,分别为空白对照组(生理盐水)、保健饮料高、中、低剂量组(相当于浙贝母花+宁海白枇杷花6.0,3.0,1.5 g/kg)和蜜炼川贝枇杷膏阳性对照组(4.0 g/kg),参考之前方法操作[2],记录小鼠咳嗽潜伏时间和3 min内咳嗽次数。其中,高剂量(相当于成人给药量的40倍量)、中剂量(20倍量)、低剂量(10倍量)组,川贝枇杷膏阳性对照组(相当于成人给药量的20倍量)。

1.2.6.2 豚鼠枸橼酸引咳实验 将豚鼠进行预试[19],筛选出合格豚鼠50只,分组及给药剂量同1.2.6.1。参考之前方法处理[2],记录豚鼠咳嗽潜伏时间及5 min内咳嗽次数。

1.3 数据处理

应用SPSS 19.0统计软件对实验数据进行统计分析,包括方差分析,显著性差异分析等。

2 结果与分析

2.1 浙贝母花提取工艺的确定

正交实验结果直观分析见表5,影响提取效果的顺序为提取时间>加水量>提取次数,确定浙贝母花最佳提取条件为表A3B3C3,即加12倍量水,每次提取2 h,提取3次。此条件下,总生物碱量为0.328%,浸膏得率为4.83%,综合评分98.66。方差分析显示,3个因素对结果影响都不显著,见表6。

表5 浙贝母花正交实验结果Table 5 Results of orthogonal experiments of Thunberg Fritillary flower

表6 浙贝母花方差分析Table 6 Analysis of variance of Thunberg Fritillary flower

2.2 宁海白枇杷花提取工艺的确定

正交实验结果及直观分析见表7,影响提取效果的顺序为提取时间>提取次数>加水量,结合大生产及耗能,确定宁海白枇杷花最佳提取条件为表A2B2C1,即加9倍量水,每次提取1.5 h,提取1次。此条件下,总黄酮量为0.368%,浸膏得率为6.04%,综合评分98.77。方差分析显示,3个因素对结果影响都不显著,见表8。

表7 宁海白枇杷花正交实验结果Table 7 Results of orthogonal experiments of Ninghaibai Loquat flower

表8 宁海白枇杷花方差分析Table 8 Analysis of variance of Ninghaibai Loquat flower

2.3 饮料配方的确定

由方差分析(表10),4个因素对结果影响都不显著。配方正交实验结果见表9,方差分析见表10。可知,对饮料品质影响最大的因素是蜂蜜的添加量,其次是木糖醇和柠檬酸的添加量,而果胶的添加量对饮料品质的影响相对较小;最优结果为A2B1C3D3,即最佳配比条件是40 g/L的木糖醇、0.5 g/L的柠檬酸、35 g/L的蜂蜜和3 g/L的果胶。经验证实验,该配方的平均得分达到92分(n=5,RSD0.37%),确定为最佳配方。

表9 配方正交实验结果Table 9 Results of orthogonal experiments of formula

表10 感官评分方差分析Table 10 Analysis of variance of sensory score

2.4 质量检测结果

随机抽取5瓶成品进行检测,该饮料中总生物碱量为(0.12±0.010) mg/mL,总黄酮量(0.40±0.018) mg/mL,这为饮料发挥保健功能奠定了基础。可溶性固形物含量(20 ℃,折光法)≥45%,pH为5.5,细菌总数≤100 CFU/mL,大肠杆菌≤0.02 MPN/mL,致病菌未检出,均符合相关规定。稳定性实验结果表明,产品在感官上变化不大,略有微量沉淀析出,pH为5.4,可溶性固形物的量保持稳定,菌落群数和大肠杆菌未超标。

2.5 药效学结果

2.5.1 对小鼠氨水引咳影响 由表11可得,与空白对照组比较,保健饮料高、中剂量组和阳性对照组蜜炼川贝枇杷膏,均能显著延长小鼠咳嗽潜伏期并减少小鼠咳嗽次数(p<0.05);保健饮料高、中剂量组与阳性对照组蜜炼川贝枇杷膏比较,未有显著差异。表明,该保健饮料能明显抑制由氨水引起的小鼠咳嗽。

表11 对小鼠氨水引咳的影响Table 11 The effects of ammonia water

2.5.2 对豚鼠枸橼酸引咳影响 由表12可知，与空白对照组比较,保健饮料高、中剂量组和阳性对照组蜜炼川贝枇杷膏,均能显著延长豚鼠咳嗽潜伏期并减少小鼠咳嗽次数(p<0.05),低剂量组虽有改善,但无统计学意义;保健饮料高、中剂量组与阳性对照组蜜炼川贝枇杷膏比较,未有显著差异。表明,该保健饮料对枸橼酸引咳豚鼠有良好的抑制作用。

表12 对豚鼠枸橼酸引咳的影响Table 12 The effects of citric acid causing cough in guinea

3 结论与讨论

本研究确定浙贝母花-宁海白枇杷花保健饮料的最佳配方为:浙贝母花提取液160 g/L,宁海白枇杷花提取物40 g/L,木糖醇40 g/L、柠檬酸0.5 g/L、蜂蜜35 g/L、果胶3 g/L。检测结果表明所研制的保健饮料工艺稳定,各项指标均符合保健食品相关规定。药理实验表明,具有显著的止咳作用。

口感是保健饮料品质评价中最重要的指标,但为了改善口感,人们通常会降低饮料主成分,导致无法发挥良好的保健功能[20]。针对这一问题,本文为确保发挥饮料的最佳保健功效,在前期实验基础上,固定了浙贝母花提取液和宁海白枇杷花提取液的配比4∶1,通过调整木糖醇、柠檬酸、蜂蜜和果胶的配比来确定饮料的口感;在产品质量检测过程中,参考《中国药典》的标准,不仅对理化指标及微生物检测指标进行检测,还对饮料中的总生物碱和总黄酮含量进行了测定,从而确保饮料中有效成分的含量,进一步保证饮料的保健功能。

[1]王翰华,周书军,张林苗.鄞州浙贝产业现状及发展对策[J].浙江农业科学,2010,(4):755-756.

[2]王翰华,杨晓春,崔明超.浙贝母叶与浙贝母花醇提物的止咳、化痰及平喘活性研究[J].天津医药,2016,44(10):1207-1209.

[3]陈晶,李琪,黄春萍,等.枇杷花总黄酮、总三萜的大孔树脂制备工艺[J].食品科学,2015,36(18):58-63.

[4]王翰华,陈仲益,陈云,等.宁波产宁海白枇杷叶的药材品质分析[J].安徽农业科学,2016,44(28):139-140.

[5]崔明超,张加余,陈少军,等.浙贝母植株各部位中生物碱和黄酮的LC-LTQ-Orbitrap MSn分析[J].中国中药杂志,2016,41(11):2124-2130.

[6]李琪,张宏,黄春萍,等.枇杷花化学成分及抗菌抗肿瘤活性研究[J].西南农业学报,2014,2(2):739-742.

[7]刘晓,林太凤.药食同源中草药在功能饮料开发中的应用进展[J].安徽农业科学,2015,43(10):81-84,86.

[8]王翰华,杨晓春,崔明超,等.浙贝母花配伍宁海白枇杷花的止咳化痰作用[J].中成药,2017,(9):1921-1923.

[9]韩鸿萍,杜晓.暗紫贝母有效成分提取工艺研究[J].安徽农业科学,2011,39(6):3288-3290.

[10]国家药典委员会编.中华人民共和国药典(四部)[M].北京:中国医药科技出版社,2015:202.

[11]王翰华,陆元勋,胡梦月,等.分光光度法测定葛根叶中总黄酮的含量[J].科技创新与应用,2015,8(12):21-22.

[12]林标声,罗茂春.蛹虫草-山楂复合保健饮料的研制[J].食品科学,2013,34(4):293-297.

[13]秦秀丽,金艳梅,邢力.蛹虫草枸杞保健饮料生产工艺条件的优化[J].江苏农业科学,2014,42(3):227-229.

[14]李尽哲,叶兆伟,黄雅琴.蛹虫草桑叶复合保健饮料的研制[J].食品研究与开发,2016,37(3):77-79.

[15]李尽哲,王德芝,黄雅琴.响应面法研制灵芝火棘复合保健饮料[J].食品工业科技,2016,37(21):238-242.

[16]赵镭,刘文,汪厚银.食品感官评价指标体系建立的一般原则与方法[J].中国食品学报,2008(3):121-124.

[17]宋慧.红枣玫瑰花复合保健饮料的生产工艺研究[J].中国食品添加剂,2013,(5):63-69.

[18]高辉,贾长英,吕忠政,等.雪莲果功能性饮料的制备研究[J].食品安全质量检测学报,2016,7(7):2835-2839.

[19]陈晓芳,张倩,吴文倩,等.枇杷花醇提物止咳化痰作用实验研究[J].中成药,2013,35(1):167-169.

[20]李尽哲,叶兆伟,黄雅琴.蛹虫草桑叶复合保健饮料的研制[J].食品研究与开发,2016,37(3):77-79.