李思宁,唐善虎,毛濛兰,胡 洋

(西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

酸奶是以鲜牛奶为主要原料,经乳酸菌发酵而形成的一种风味独特、营养丰富的功能性乳制品[1]。在实际的生产、运输、储藏过程中,凝固型酸奶普遍存在因凝胶脆弱导致组织状态破坏及乳清析出等问题,严重影响了酸奶的品质[2],这些缺陷可以通过添加稳定增稠剂或者蛋白质交联改性来解决。

目前,牛奶蛋白的交联改性研究主要集中于谷氨酰胺转氨酶(TG酶)的应用。TG酶是一种催化蛋白质中赖氨酸上的ε-氨基和谷氨酸上γ-羟酰胺基之间的结合反应,通过转谷氨酞胺作用形成共价化合物的聚合酶[3]。Schorsch等[4-5]研究表明,在发酵阶段,牛奶中的酪蛋白胶束会受TG酶的影响而减少分散。苏海龙[6]研究了TG酶在凝固型酸奶中的应用,发现加入TG酶可以使凝固型酸奶的乳清析出率降低,持水力提高,表观黏度增加,感官品质提高。吕佳平等[7]进行了TG酶提高酸奶品质的工艺研究,并优化了酶的应用工艺及技术参数,结果表明酶的处理方式为反应后不灭酶,酶的适宜添加量为0.15 g/L。综上所述,TG酶可改善酸奶品质。

漆酶(Laccase)是一种多酚氧化酶,含4个Cu2+,聚合蛋白质或肽类物质,也可在酚酸存在的条件下使乳清蛋白发生交联聚合[8]。Mokoonlall[9]研究了漆酶对酸奶和奶酪蛋白质的氧化作用,发现漆酶可加快酸奶凝乳,使酸奶的孔隙增多,而黏度和保质期不受影响。Wang[10]认为漆酶剂量是影响其在牛奶中氧化作用的重要因素,低剂量条件下漆酶可使蛋白发生有效交联,转化为更高分子量的蛋白质聚合物,蛋白质流变学特性增强,但高剂量漆酶会使蛋白质发生降解,破坏牛奶品质。关于漆酶交联对乳蛋白游离氨基酸变化率、酸奶感官、质构、乳蛋白质变化及微观结构品质变化的影响尚未见报道。

阿魏酸(Ferulic Acid,FA)是植物界普遍存在的一种酚酸,主要使用麦麸、玉米麸皮等作为原材料来提取[11-12]。阿魏酸在食品中的应用非常广泛,日本已批准其作为抗氧化剂用于食品防腐保鲜。阿魏酸也可作为食品交联剂,结合蛋白质[13-14]。在制备可食性蛋白膜时,阿魏酸能增加膜的机械强度,并降低膜对水蒸气和氧气的透性[15]。阿魏酸也可通过减少蛋白质中游离氨基含量,避免蛋白质中游离氨基引起交联而增加乳品在加热过程中的热稳定性[16]。然而,阿魏酸与漆酶结合用于酸奶蛋白质交联对酸奶的品质影响也未见报道。

本文通过在双歧杆菌益生菌酸奶制备过程中添加TG酶和漆酶,对比两种酶在酸奶中蛋白质交联的作用及对益生菌酸奶质构及组织结构变化的影响,并通过添加阿魏酸改善漆酶酸奶的品质,旨在为解决凝固型酸奶的品质缺陷提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

鲜牛奶(蛋白质含量2.84 g/100 g) 四川新华西乳业有限公司;蔗糖 太古糖业;混合发酵剂(保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌) 北京川秀科技有限公司;双歧杆菌 中国工业微生物菌种保藏管理中心;谷氨酰胺转氨酶(活力≥100 U/g) 湖北远成药业有限公司;漆酶(活力≥100 U/g) 德国Ruibio公司;阿魏酸、戊二醛(电镜专用) 上海Aladdin公司;电泳用蛋白Marker 天根生化科技有限公司;缓冲液(5×) 上海碧云天生物技术有限公司;L-亮氨酸、邻苯二甲醛(OPA)、甲醇、三氯乙酸(TCA)、四硼酸钠、β-巯基乙醇、冰乙酸、无水乙醇、溴酚蓝、叔丁醇 均为分析纯,成都市科龙化工试剂厂;考马斯亮蓝R-250、丙烯酰胺(Acr)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、十二烷基硫酸钠(SDS)、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺(TEMED)、甘氨酸、过硫酸铵(APS) 均为电泳级,美国Sigma公司。

TA.XT.plus质构仪 英国Stable Micro Systems公司;NS1001L型高压均质机 意大利Niro Soavi公司;BROOKFIELD DV-Ⅲ Ultra流变仪 美国Brookfield公司;JSM-7500F场发射扫描电子显微镜(SEM) 日本电子株式会社;DHP-9052电热恒温培养箱 上海齐欣科学仪器有限公司;HH-6数显恒温水浴锅 国华电器有限公司;UV-2102 PCS型紫外分光光度计 龙尼克仪器有限公司;Mini 电泳槽 美国Bio-Rad公司;DYY-12型电泳仪 北京市六一仪器厂;Versa Doc 1000凝胶成像系统 美国Bio-Rad公司;ALPHA 1-4 LSC型冻干机 德国Christ公司。

1.2 实验方法

1.2.1 益生菌酸奶制备流程及操作要点 益生菌酸奶制备工艺流程:

双歧杆菌活化:取100 mL鲜牛奶,加入1%的双歧杆菌,37 ℃恒温培养至凝乳。取10 g凝乳,另加100 mL鲜牛奶,搅拌均匀,37 ℃恒温培养,凝固后放入4 ℃冰箱保存,备用。

在新鲜牛奶中加入6%蔗糖,搅拌均匀。将调配好的奶预热到60 ℃,采用20 MPa压力均质2次。按照实验设计加入不同的酶,交联温度50 ℃,交联时间1 h,加热至90 ℃保持15 min进行灭酶和杀菌,并快速冷却至45 ℃左右;接种1‰保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌混合发酵剂及5%活化后的双歧杆菌,在42 ℃培养箱中发酵培养至发酵终点(30°倾角倾斜发酵而料液无流动)后,取出放在4 ℃后熟36 h。

1.2.2 实验设计

1.2.2.1 TG酶对益生菌酸奶品质的影响 TG酶使用量选择0、0.6、1.2、1.8、2.4、3.0 U/g。通过游离氨基变化率、感官、质构、表观黏度对后熟后的酸奶进行分析,确定TG酶的最佳添加量。

1.2.2.2 漆酶对益生菌酸奶品质的影响 漆酶使用量选择0、0.15、0.3、0.6、0.9、1.2 U/g。通过游离氨基变化率、感官、质构、表观黏度对后熟后的酸奶进行分析,确定漆酶的最佳添加量。

1.2.2.3 阿魏酸对漆酶交联益生菌酸奶品质的影响 在牛奶中加入1.8 U/g漆酶的同时,分别加入0、1.5、3、4.5、6、7.5 mmol/L的阿魏酸。通过游离氨基变化率、感官、质构、表观黏度对后熟后的酸奶进行分析,确定阿魏酸的最佳添加量。

根据以上3个实验确定的TG酶、漆酶、阿魏酸+漆酶的最佳使用量,制备不同酶交联益生菌酸奶,然后对TG酶交联酸奶、漆酶交联酸奶及阿魏酸+漆酶交联酸奶和对照组(不添加酶及阿魏酸)酸奶进行电泳分析和电镜扫描,评价酸奶的蛋白交联情况及组织质构。

1.2.3 测定指标

1.2.3.1 游离氨基变化率 参考Church[17]的方法测定游离氨基变化率。主要包括亮氨酸标准曲线的建立和蛋白质中游离氨基含量的测定两个步骤,具体为:a. 将亮氨酸配制成浓度为0、180、270、360、450、540、630、720 μg/mL的标准溶液,准确移取300 μL标准溶液与6 mL的邻苯二甲醛试剂混合后摇匀,2 min后在340 nm下测定吸光度。以亮氨酸浓度为横坐标,反应后的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线;b. 采用邻苯二甲醛法测定蛋白质中游离氨基含量,并计算游离氨基变化率。将40 mg的邻苯二甲醛溶于1 mL甲醇中,分别加入100 mmol/L的四硼酸钠25 mL、10% 十二烷基磺酸钠 2.5 mL、β-巯基乙醇100 μL,加水定容至50 mL,配制邻苯二甲醛试剂。取10 mL待测的酸奶样品在4000 r/min离心20 min。取后熟后的酸奶样品2.5 mL,分别加入5 mL质量分数为12%的三氯乙酸、0.5 mL蒸馏水,在2000 r/min离心15 min。取清液300 μL,加入6 mL邻苯二甲醛试剂,室温下反应2 min,340 nm下测定其吸光度值。根据亮氨酸标准曲线计算出酸奶中游离氨基的浓度;游离氨基变化率使用下面公式计算。

式中,M1:交联前蛋白质中游离氨基的含量,μg/mL;M2:交联后蛋白质中游离氨基含量,μg/mL。

1.2.3.2 感官评价 酸奶后熟完成后,随机编号,邀请经过培训的10位食品专业人员，男女各一半,从产品的色泽、组织状态、滋味以及气味这四个方面进行感官评定,逐项记分。评分标准[18]见表1。

表1 酸奶感官评定标准Table 1 Score card for fermented milk sample

1.2.3.3 质构 质构测定参考李春红[19]的方法:A/BE活塞探头,探头压盘直径:35 mm。其测定参数为:探头运行测前速率:1.0 mm/s;测试速率:1.0 mm/s;测后速率:10.0 mm/s;穿透测试距离:30 mm;触发器类型(感应力):Auto-10.0 g。

1.2.3.4 表观黏度 用RVDV-III Ultra型旋转黏度计测定酸奶的黏度值,转子为RV5,设定转速2.5 r/min,扭矩10%～100%,测定时间30 s。

1.2.3.5 SDS-PAGE 参考Laemmli[20]的方法并略作修改。将待测酸奶稀释至蛋白质浓度为5 mg/mL,取50 μL溶液于1.0 mL离心管中与样品上样缓冲液按1∶1混合均匀,沸水浴中煮5～10 min,12000 r/min离心10 min,除去不溶性颗粒,上清液用于电泳分析。用微型进样器上样,每孔进样量为10 μL;样品在80 V电压进行浓缩,待溴酚蓝前沿进入分离胶后加压至120 V,待溴酚蓝距离下缘 0.5～1.0 cm 时结束电泳。然后对电泳胶进行染色和脱色,用考马斯亮蓝R-250染色液对胶染色0.5～1 h,更换成脱色液,3 h后更换一次脱色液,脱色24 h,直至条带清晰、背景色完全褪去为止;最后用蒸馏水清洗和用7%冰乙酸保存。SDS-PAGE分离胶和浓缩胶成分见表2。

表2 SDS-PAGE分离胶和浓缩胶成分Table 2 Composition of separating and stacking gel of SDS-PAGE

1.2.3.6 微观结构 参考马力[21]的方法测定。用药匙挑取酸奶中心的凝块若干,放在2.5%的戊二醛溶液中,于4 ℃固定10 h。用0.9%的生理盐水清洗样品3次,每次10 min,然后用液氮迅速处理样品后,用锤子轻轻锤击,使之自然断裂。采用30%、50%、70%、90%和100%乙醇分别对样品脱水10 min,再用叔丁醇置换乙醇10 min;将置换后的样品在-80 ℃预冷,24 h后迅速转移到冻干机中进行冷冻干燥10 h(温度-55 ℃,压力<0.1 MPa)。采用离子溅射仪镀铂金膜,观察微观结构并记录。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 游离氨基变化率

以游离氨浓度为横坐标,以340 nm处的吸光值为纵坐标做标准曲线,吸光值Y与游离氨浓度X的线性方程:Y=0.0018X+0.0171,R2=0.9972,线性关系良好,可以用于样品中游离氨基(亮氨酸)的测定。通过游离氨基变化率公式计算,得到TG酶、漆酶交联酸奶游离氨基变化率见表3,阿魏酸+漆酶交联酸奶游离氨基变化率见图1。

由表3可知,经TG酶交联后,酸奶的游离氨基变化率呈显著上升的趋势(p<0.05),当TG酶用量为1.8 U/g时,酸奶的游离氨基变化率达到67.42%,之后再增加TG酶用量,游离氨基变化率无显著变化(p>0.05);经漆酶交联后,酸奶的游离氨基变化率呈先上升后下降的趋势,当漆酶用量为0.3 U/g时,酸奶中的的游离氨基最高,且显著高于其他用量所得游离氨基变化率(p<0.05)。

表3 不同酶交联酸奶游离氨基变化率Table 3 The rate of change of free amino groups of different enzymes crosslinked yogurt

由图1可知,在确定漆酶最佳使用量后,随着阿魏酸添加量的增加,酸奶的游离氨基变化率先增大后减小,当阿魏酸添加量为4.5 mmol/L,显著提高了漆酶交联酸奶的交联程度(p<0.05)。

图1 阿魏酸+漆酶交联酸奶游离氨基变化率Fig.1 The rate of change of free amino groups of yoghurt treated with ferulic acid and laccase注:不同小写字母表示差异显著(p<0.05), 相同小写字母表示差异不显著(p>0.05);图3～图4同。

酶与蛋白质相互作用,增强了蛋白质网络的稳定性。无论是哪种交联方式,交联程度越高,形成的酶-蛋白质复合物结构越强,改善了酸奶的性能[22]。TG酶交联是共价交联,形成的凝胶主要是三维的类固体网络结构,当增加TG酶的量,酶与底物作用交联程度增加,继续增加酶的用量,酶与底物作用达到饱和,交联反应难以进行[23]。目前,关于TG酶与牛奶蛋白质的作用机理的研究已有很多报道。漆酶交联是直接氧化交联蛋白质酪氨酸残基上的苯环,形成二硫-铜的结合物。国外学者[24-25]对漆酶催化乳蛋白进行了研究,发现漆酶能促使乳蛋白发生分子间的交联反应。Wang[10]报道高剂量的漆酶会使蛋白质发生降解,这可能是导致漆酶交联酸奶随漆酶使用量增加而交联程度显著下降的原因。漆酶与牛奶蛋白质的作用机理较复杂,具体是如何影响牛奶蛋白质的交联情况有待进一步研究。

2.2 感官评价

TG酶、漆酶交联酸奶感官评价见表4,阿魏酸+漆酶交联酸奶感官评价见图2。

过量的TG酶会使酸奶产生苦味,过量的漆酶则造成酸奶凝乳偏软,且酶使用量过多,成本高。由表4可知,经TG酶交联后,随TG酶用量的增加,酸奶的感官得分先增大后减小,添加量为1.2、1.8、2.4和3.0 U/g酸奶的感官评分差异不显著(p>0.05);经漆酶交联后,随漆酶用量的增加,酸奶的感官得分先增大后减小,且添加量为0.3 U/g时的感官评分显著高于其他水平(p<0.05)。

表4 不同酶交联酸奶感官评价Table 4 The sensory value of different enzymes crosslinked yogurt

由图2可知,添加阿魏酸后,能够显著改善酸奶的感官(p<0.05),但是过量添加阿魏酸会显著降低漆酶交联酸奶的感官(p<0.05),主要表现在阿魏酸添加量为6 mmol/L和7.5 mmol/L时,酸奶的质地变软、凝乳性能变差。当阿魏酸添加量为4.5 mmol/L时,酸奶的感官品质最好。

图2 阿魏酸+漆酶交联酸奶感官评价Fig.2 The sensory value of yoghurt treated with ferulic acid and laccase

2.3 质构特性

TG酶和漆酶交联酸奶的质构特性见表5和表6,阿魏酸+漆酶交联酸奶质构变化见表7。

表5 TG酶交联酸奶质构Table 5 Hardness,gumminess,adhesiveness and cohesiveness of TGase cross-linking yogurt

表6 漆酶交联酸奶质构Table 6 Hardness,gumminess,adhesiveness and cohesiveness of laccase cross-linking yogurt

表7 阿魏酸+漆酶交联酸奶质构Table 7 Hardness,gumminess,adhesiveness and cohesiveness of ferulic acid and laccase cross-linking yogurt

由表5可知,随TG酶添加量的增加,内聚性增加不显著(p>0.05);TG酶添加量≤1.8 U/g,TG酶交联酸奶的硬度、胶黏性及粘聚性显著上升(p<0.05);TG酶添加量>1.8 U/g,酸奶的硬度、胶黏性及粘聚性不同程度降低。

由表6可知,随漆酶使用量的增加,漆酶交联酸奶的硬度、胶黏性、粘聚性和内聚性均先增大后减小,且漆酶使用量为0.3 U/g时,硬度、胶黏性和内聚性显著高于其他水平；粘聚性略高于其他水平。综上所述,TG酶和漆酶均能提高酸奶的硬度、胶黏性和粘聚性。

由表7看出,添加阿魏酸后,随阿魏酸添加量的增加,漆酶交联酸奶的硬度、胶黏性、内聚性及粘聚性均先上升后下降,综合各指标结果,选择阿魏酸添加量为4.5 mmol/L。

2.4 酶交联酸奶表观黏度

TG酶、漆酶交联酸奶表观黏度见表8,阿魏酸+漆酶交联酸奶表观黏度见图3。

由表8可知,经TG酶和漆酶交联后,酸奶的表观黏度均先增大后减小。在酶的催化下,酸奶的表观黏度增大是由于酶使蛋白质交联成很大的聚合物,使蛋白质的分子量增加,从而增加酸奶的黏度[22];但过度交联又使蛋白质的空间结构过于紧密,抑制其均匀发展,从而降低了黏度[26]。

表8 不同酶交联酸奶表观黏度Table 8 The apparent viscosity of different enzymes crosslinked yogurt

由图3看出,在确定漆酶最佳使用量后,随着阿魏酸添加量的增加,酸奶的表观黏度呈先上升后下降的趋势,当阿魏酸添加量为4.5 mmol/L,酸奶表观黏度最大。阿魏酸的存在使得乳蛋白质交联程度增加,大分子蛋白质增多,黏度增大[27]。

图3 阿魏酸+漆酶交联酸奶表观黏度Fig.3 The apparent viscosity of yoghurt treated with ferulic acid and laccase

综合上述游离氨基变化率、感官、质构及表观黏度等指标,选择酶交联酸奶的TG酶和漆酶最佳用量分别为1.8 U/g和0.3 U/g,漆酶交联酸奶中,阿魏酸的最佳添加量为4.5 mmol/L。

2.5 酶交联酸奶SDS-PAGE

TG酶、漆酶交联益生菌酸奶SDS-PAGE图谱见图4。乳中的蛋白质主要由酪蛋白、乳清蛋白、乳脂肪球膜蛋白等组成,含量为2.8%～3.7%。酪蛋白包括α-酪蛋白(α-CN)、β-酪蛋白(β-CN)、κ-酪蛋白(κ-CN)和γ-酪蛋白(γ-CN),其中γ-CN是乳中蛋白酶分解β-CN产生的,实际上乳中酪蛋白只有前3种类型;酪蛋白分子量在20～40 kDa,主要集中在31 kDa范围。乳清蛋白包括α-乳白蛋白(α-la)、β-乳球蛋白(β-lg)、血清白蛋白及乳铁蛋白等,各组分理论分子量分别为14、18、66和76 kDa[28]。由图4可以看出,所有酸奶样品的β-lg条带都消失了,这一现象可能是由于双歧杆菌对蛋白质降解导致的,具体原因有待进一步研究。与对照(泳道3)及漆酶酸奶(泳道5和6)相比,经TG酶交联后,酸奶(泳道4)不存在κ-CN和β-CN条带,而是聚集成了新的蛋白质,分子量在55～68 kDa,与常忠义[29]研究结论一致,同时也论证了酪蛋白是TG酶的良好底物[30];与只添加阿魏酸(泳道1)相比,经漆酶交联后,漆酶酸奶(泳道5)及阿魏酸+漆酶酸奶(泳道6)的蛋白质条带基本没有发生变化。但与对照(泳道3)和TG酶酸奶(泳道4)相比,漆酶酸奶(泳道5)及阿魏酸+漆酶酸奶(泳道6)分子量在14 kDa的蛋白条带明显变宽,表明在漆酶、阿魏酸作用下,牛乳中一些比α-la更小分子量的蛋白质聚集成了新的蛋白质,新蛋白质的分子量在14 kDa附近,这也进一步说明漆酶、阿魏酸作用的是小分子乳蛋白。

图4 不同酶交联益生菌酸奶SDS-PAGE图谱Fig.4 SDS-PAGE pattern of different enzymes crosslinked yogurt注:1:阿魏酸;2:蛋白marker;3:对照;4:TG酶(1.8 U/g); 5:漆酶(0.3 U/g);6:阿魏酸+漆酶(4.5 mmol/L)。

2.6 酶交联酸奶微观结构

对不同酶交联益生菌酸奶的微观结构进行观察,样品对应的扫描电镜图片见图5,所有样品的放大倍数均为8000倍。

图5 不同酶交联益生菌酸奶扫描电镜图(8000×)Fig.5 SEM photographs of different enzymes crosslinked yogurt(8000×)注:A:对照;B:TG酶酸奶(1.8 U/g);C:漆酶酸奶(0.3 U/g);D:阿魏酸+漆酶酸奶(4.5 mmol/L)。

由图5可知,所有酸奶的内部都形成了三维立体网络结构,所有的网络结构都是由球形酪蛋白胶束堆砌而成,而由球形酪蛋白胶束形成的三维网络结构比较脆弱,是造成酸奶硬度较低的一个原因[31-32]。有文献报道,在酸性乳体系中,体系中粒子间的静电斥力越强烈,越有利于链状结构的形成,因为粒子间斥力越强烈,体系内部粒子分散得越均匀,粒子越容易有规律地排列在一起而形成链状结构;而链状分支越多,则越有利于胶粒间的交联作用,这对于形成稳定强有力的网络结构是很有利的[33-34]。

在对照酸奶样品(A)中,胶粒间空隙较多且较大,空隙的大小分布在0～7 μm,形成的网络结构较疏松;经TG酶、漆酶交联的酸奶,三维网络结构变得致密,胶粒间的空隙变小,结构也变得平滑。相对于漆酶交联酸奶(C),TG酶交联酸奶(B)的胶粒更大、分布更加均匀,网络结构更加致密。在漆酶交联酸奶中添加了阿魏酸后,酸奶(D)的蛋白胶束更加均匀,空隙的数量也减少。有研究表明,酸奶的微观结构在很大程度上反映了其持水力、质构以及流变学性质等[35]。酸奶的扫描电镜图进一步论证了TG酶和漆酶对酸奶的交联程度、质构及表观黏度都有改善作用。

3 结论

通过对比TG酶、漆酶与牛奶蛋白交联对双歧杆菌益生菌酸奶游离氨基变化率、感官、质构特性及表观黏度的影响,得到:TG酶和漆酶均能够明显提高酸奶的游离氨基含量,改善酸奶的感官、质构等特性。当TG酶、漆酶用量分别为1.8和0.3 U/g时,这两种酶制备的益生菌酸奶的游离氨基含量、感官、质构及表观黏度最好。添加阿魏酸明显提高了漆酶交联酸奶的交联程度,阿魏酸的最适添加量为4.5 mmol/L。

在确定了TG酶、漆酶、阿魏酸的最适用量后,通过对酸奶进行电泳分析和电镜扫描,得到:所有双歧杆菌酸奶样品均缺少β-lg条带;与对照及漆酶酸奶相比,TG酶交联酸奶κ-CN和β-CN条带消失,聚集成了新的蛋白质;相较于对照及TG酶酸奶,漆酶交联酸奶及阿魏酸+漆酶酸奶分子量在14 kDa的蛋白条带明显变宽。经TG酶和漆酶交联的酸奶,三维网络结构变得致密,胶粒间的空隙变小,结构也变得平滑,但TG酶交联酸奶的胶粒分布更加均匀,网络结构更加致密;阿魏酸能够提高漆酶交联酸奶的蛋白胶束聚集程度。

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