赵利利,李志田,李彬彬,薛林林,卢士玲,樊庆鲁

(1.石河子大学食品学院,新疆石河子 832000; 2.新疆农垦科学院，新疆石河子 832000)

组胺是毒性最大的生物胺[1],适量的组胺对人体的各种生理机能有调节作用,而组胺量过高会导致中毒甚至有生命危险[2]。中毒症状表现为头痛、心跳呼吸加快、血压下降等[3]。组胺是游离组氨酸在微生物的组氨酸脱羧酶作用下,发生脱羧反应产生的[4]。研究发现许多微生物可以产生组胺[5-6],因此,控制产组胺菌的生长是减少组胺中毒最有效的方法[7]。在发酵香肠的生产、贮藏和销售过程中均会有组胺的积累[8-10]。所以在香肠发酵过程中使用添加剂对组胺的控制非常重要。

阿魏酸是酚类化合物的一种,存在于水果、粮食、蔬菜、中药等中。阿魏酸安全低毒,具有一定的抑菌作用[11]。据报道,它还具有多种生理功能,对多种疾病,包括癌症、糖尿病、心血管和神经性疾病都有广泛的治疗作用[12]。阿魏酸在日本被正式批准为食品添加剂,可以加入饼干、熟食,主要用作食品抗氧化剂提高食品质量[13]。魏延玲[14]在阿魏酸对风干鲈鱼中N-亚硝胺及生物胺的抑制作用的研究中发现阿魏酸对组胺有很好的抑制作用,使用阿魏酸能显著抑制(p<0.05)风干鲈鱼加工及贮藏过程中微生物的生长。而关于阿魏酸能否抑制熏马肠中组胺的研究还未见报道。

本研究旨在利用阿魏酸对熏马肠中高产组胺的大肠杆菌(Escherichiacoli)和蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)的作用效果进行研究,为阿魏酸应用于熏马肠及其他发酵香肠提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

阿魏酸(纯度98%)、组氨酸(纯度99%) 北京博奥拓科技有限公司;甲醇、乙腈(均为色谱纯) 赛默飞世尔科技(中国)有限公司;组胺(纯度97%)、丹磺酰氯(纯度99%)和组氨酸(纯度99%) 美国Sigma公司；NH4OH(纯度25%)、乙醇(纯度99%)、NaHCO3(纯度99%)和NaOH(纯度96%) 天津永晟精细化工有限公司；磷酸吡哆醛(纯度99%) 上海瑞永生物科技有限公司；高氯酸(纯度72%) 天津政成化学制品有限公司；丙酮(纯度99%) 济南源飞伟业化工有限公司；微生物选择性培养基:改良后的MSA(NaCl减半)、VRBGA 天津市盛奥化学试剂有限公司;供试菌株(见表1) 前期从熏马肠样品中分离。

表1 供试菌株Table 1 Strains used in the experiment

LDZX-40型立式压力蒸汽灭菌锅 上海申安医疗器械厂;岛津LC-2010AHT型高效液相色谱仪 日本岛津公司;ZXRD-7080型全自动新型鼓风干燥箱 上海一恒科技有限公司;EPED-20TJ型实验室超纯水器 南京易普易达科技发展有限公司;ZHWY-1111型落地普通型大容量恒温培养振荡器 上海智城分析仪器制造有限公司;DNP-9272型恒温培养箱 上海精宏有限公司;KQ-250B型超声波清洗器 江苏同君仪器科技有限公司;UB-7型pH计 美国赛多利斯丹佛公司。

1.2 实验方法

1.2.1 阿魏酸抑菌能力的测定 将活化好的菌液稀释为105、106、107CFU/mL,备用。采用稀释平板菌落计数法,通过比较添加阿魏酸与未添加阿魏酸菌落数的差值,确定阿魏酸的抑菌能力。根据阿魏酸的使用浓度,用相同体积的乙醇溶解后,准确加入到对应的MSA和VRBGA固体培养基中,灭菌,冷却至50 ℃左右,倒板,待平板充分凝固后,加入100 μL稀释到合适的梯度菌悬液进行涂布,在37 ℃培养24 h,待菌落总数不再显著增加时进行菌落计数。每个处理取两个重复,另设对照组(不加阿魏酸只加入一定量的乙醇),结果取平均值,计算菌落总数及抑菌率[15]。

抑菌率(%)=(CK菌落数-处理组菌落数)/CK菌落数×100

1.2.2 阿魏酸最低杀菌浓度(Minimal Bactericidal Concentration,MBC)和最低抑菌浓度(Minimal Inhibitory Concentration,MIC)的测定 本实验采用双倍琼脂稀释法测定最低抑菌浓度。准备9个锥形瓶,编号,锥形瓶中先分别加入等量的固体培养基。不同浓度的阿魏酸用乙醇溶解后(浓度以锥形瓶中固体培养基和乙醇的混合液计),分别加入到相应的锥形瓶中。1号锥形瓶中加入浓度为0.5%的阿魏酸稀释液,2号锥形瓶中加入浓度为0.25%的阿魏酸稀释液,3号锥形瓶中加入浓度为0.13%的阿魏酸稀释液，以此类推,8号锥形瓶中加入浓度为0.0039%的阿魏酸稀释液,9号锥形瓶中不加阿魏酸只加入一定量的乙醇(空白对照组),灭菌后倒板,接种100 μL浓度稀释为106CFU/mL的菌液。在37 ℃恒温培养箱中培养24 h后,以完全没有菌生长的最低浓度作为该阿魏酸的MIC，将完全没有菌生长的平板用接种针挑取一部分直径为5 mm的饼转接至新鲜无菌平板上，培养24 h后若仍不生长菌，则为MBC[16-17]。

1.2.3 阿魏酸对待测菌株生长的抑制作用 利用MIC浓度研究阿魏酸对供试菌生长过程的抑制作用。准备两份等量的固体培养基,一份中加入阿魏酸,一份不加阿魏酸做空白对照组。将活化的菌液分别在0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h间隔时间内接种涂布平板。

1.2.4 pH的测定 共设计四组来测定pH:不加阿魏酸和组氨酸的空白对照组(C);加阿魏酸不加组氨酸组(F);不加阿魏酸加组氨酸组(H);加阿魏酸加组氨酸组(FH)。共准备156个试管,每组39个试管。在C组试管中加入4.8 mL液体培养基和200 μL乙醇做空白对照组;在F组试管中加入4.8 mL液体培养基和200 μL乙醇溶解的浓度为MIC的阿魏酸稀释液(浓度以试管中的液体培养基和乙醇混合液计);在H组试管中加入4.8 mL含浓度为0.005%磷酸吡哆醛、0.05%组氨酸的液体培养基和200 μL乙醇;在FH组试管中加入4.8 mL含浓度为0.005%磷酸吡哆醛、0.05%组氨酸的液体培养基和200 μL乙醇溶解的浓度为MIC的阿魏酸稀释液。灭菌后接种菌液。分别在培养0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h后,取出对应组测定pH。

1.2.5 HPLC测定菌液中组胺的含量

1.2.5.1 组胺标准溶液的配制与柱前衍生 准确称取组胺10 mg,用0.4 mol/L的高氯酸定容至10 mL容量瓶中,稀释至最终浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL组胺标准溶液。取1 mL组胺标准液,加入200 μL 2 moL/L NaOH使之呈碱性,再加入300 μL饱和NaHCO3溶液进行缓冲,然后加入2 mL丹磺酰氯溶液(DNS-Cl,10 mg/mL溶于丙酮中),在40 ℃下处于黑暗中反应45 min后,加入100 μL NH4OH终止反应,静置30 min后,去除未反应的残留Dns-Cl溶液。加入2.4 mL乙腈使终体积为5 mL。衍生处理后用0.22 μm过滤器处理后,上机分析。

1.2.5.2 样品的衍生化 取5支试管,每管中分别加入4.8 mL含浓度为0.05%组氨酸和0.005%磷酸吡哆醛的液体培养基,再分别加入200 μL乙醇溶解的阿魏酸稀释液,阿魏酸浓度分别为0.000、0.016%、0.031%、0.063%、0.130%(浓度以试管中的液体培养基和乙醇混合液计),灭菌后接种100 μL待测B.cereus菌液，另取5支试管，做同样的处理，灭菌后接种100 μL待测E.coli菌液。灭菌后接种100 μL待测菌液,在37 ℃培养箱中培养72 h,取菌液1 mL,12000 r/min高速冷冻离心10 min,移取上清液0.5 mL加入0.4 mol/L高氯酸0.5 mL,此后衍生处理方法同1.2.5.1。过膜后置于样品瓶中,避光4 ℃保藏,一周可用于分析和测试[18]。

1.2.5.3 色谱条件 色谱柱为Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm),流速0.8 mL/min,流动相A为超纯水,流动相B为乙腈,用0.22 μm滤膜过滤超声30 min后备用,紫外检测波长为254 nm,进样体积20 μL,柱温30 ℃,梯度洗脱程序:0～5 min,A(35%～25%);5.01～24 min,A(25%～0%);25～30 min,A(35%)。

1.2.5.4 线性实验 取浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10、20 μg/mL组胺标准溶液，参照1.2.5.1方法衍生化后上机分析，测定组胺的峰面积。

1.2.5.5 精密度实验 取浓度为10 μg/mL组胺标准溶液，参照1.2.5.1方法衍生化后上机分析。连续进样6次。

1.2.5.6 重复性实验 取同一供试菌液样品6份，按1.2.5.1方法衍生化后进行HPLC分析。

1.2.5.7 稳定性实验 取同一供试菌液样品，按1.2.5.1方法衍生化后进行HPLC分析，24 h内每2 h进样一次。

1.2.5.8 回收率试验 取已知含量的供试菌液样品9份，添加浓度为10 μg/mL组胺标准溶液，按1.2.5.1方法衍生化后进行HPLC分析

1.3 数据分析

全部实验数据采用Microsoft Excel 2007统计抑菌率,Origin 8.5绘图,dps2005进行差异性分析。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸的抑菌能力

不同浓度的阿魏酸对两种供试菌株均有不同程度的抑制效果(图1)。由于待测菌种的种类不同抑制效果有一定的差异。由图1可知,随着阿魏酸浓度的增加,待测菌株的抑制率也在增加(p<0.05)。当阿魏酸的浓度达到0.06%时,待测菌种的抑制率最大,B.cereus抑菌率为45.01%,E.coli抑菌率为60.15%。目前对阿魏酸抑菌机理的研究相对较少,其中吕珍等[19]认为阿魏酸使质膜蛋白含量的升高,H+-ATPase活性的降低,从而通过破坏酒类酒球菌细胞膜结构抑制生长而达到抑菌作用,也有研究认为阿魏酸通过抑制细菌N-乙酰转移酶而达到其抗菌作用。

图1 阿魏酸对待测菌株的抑菌率(IR)Fig.1 Inhibitory ratios(IR)of ferulic acid on microorganisms

2.2 阿魏酸的最低杀菌浓度(MBC)和最低抑菌浓度(MIC)

从表2中见,不同浓度的阿魏酸对待测菌种的生长有不同程度的抑制作用。E.coli和B.cereus的MIC分别为0.031%和0.063%,MBC均为0.063%。阿魏酸对不同菌株的MBC通常等于或者略高于其MIC,E.coli对阿魏酸的敏感程度较B.cereus相对较高。在先前的报道中,阿魏酸已经被证实对大肠杆菌和葡萄球菌均有一定的抑制作用[20]。高婷婷等[16]研究得到新疆阿魏根醇提物对葡萄球菌和芽孢杆菌的最小抑菌浓度分别为31.25 mg/mL和3.91 mg/mL,这一数值与本研究结果相差数倍,可能由于新疆阿魏根中阿魏酸的含量较少(平均含量为3.68 μg/mg)[21]。

表2 阿魏酸对待测菌种的MIC和MBCTable 2 The MIC and MBC of ferulic acid against the tested microorganisms

2.3 阿魏酸对待测菌液生长抑制作用的测定

由图2和图3可知,培养初期,在阿魏酸的作用下,供试菌的菌数被控制在一个恒定的范围内,而且在很长一段时间内,菌数增长的幅度不大。添加加阿魏酸和未加阿魏酸的菌液,共同经历着延滞期、对数生长期和稳定期等三个阶段,添加阿魏酸的菌液三个时期相比较空白对照组时间均延迟。由此可知,阿魏酸并没有改变微生物的生长趋势,只是减弱了它对各个时期的界限。同时也可以得到E.coli菌株在第18 h完成对数期,而B.cereus菌株在第15 h就完成了对数期。通过测定微生物生长情况,初步确定阿魏酸对供试菌的作用方式和抑制效果。由于阿魏酸的抑制作用与其亲脂性有关,因此对不同菌株的抑制程度有所不同。吕珍等[19]在阿魏酸对酒类酒球菌生长作用机理的研究中也发现:3个菌株在没有添加阿魏酸的条件下,都表现出良好的生长特性,添加了阿魏酸之后,3个菌株的生长均受到明显抑制,生长速率相对较慢,需较长的时间才能进入稳定期,但依然表现出了显著的菌株生长特性。

图2 阿魏酸对E. coli生长抑制作用Fig.2 The inhibition of ferulic acid against growth of E. coli

图3 阿魏酸对B. cereus生长抑制作用Fig.3 The inhibition of ferulic acid against growth of B. cereus

2.4 阿魏酸对待测菌株生长过程中pH的影响

由图4和图5可知,在不含组氨酸底物的VRBG和MSA培养液中分别接种供试菌株(C、F组)pH变化情况,不添加阿魏酸的培养液中供试菌(C组)进入对数生长期后,菌数达到最大值,导致pH迅速下降。E.coli(图4)和B.cereus(图5)分别在18 h和15 h以后进入稳定期,菌数增长缓慢,pH也随之缓慢下降,最终pH分别在5.47和7.20左右。图中C、F曲线变化差别较大,添加阿魏酸培养液的pH趋于稳定后要高于未添加的C组,说明阿魏酸对供试菌的生长具有一定的抑制作用。在36 h连续培养过程中,在含组氨酸底物的VRBG和MSA培养液中接种供试菌株(H、FH组)pH均呈现对数期前逐渐下降,对数期后逐步上升的趋势;这是由于在本研究中体系的pH主要受供试菌产生的组胺影响,随着供试菌菌数的不断增加,组胺的含量也在不断累积,而组胺是一类碱性物质,会中和供试菌生长过程中所产的酸。在含组氨酸底物的VRBG和MSA培养液的H组,供试菌株在对数期后的pH上升速率最快,随后分别保持在7.01和7.62左右,由此可以得出,两株菌都具有较强的产组胺能力,在菌株生长过程中由于组胺的大量产生,导致了pH的快速上升。而在含组氨酸底物的VRBG和MSA培养液基础上添加阿魏酸的FH组,pH也具有上升趋势,但与H组相比差异性非常显著,说明阿魏酸虽然抑制了供试菌株的生长,但并未将供试菌株杀死。对比图4和图5可发现,阿魏酸对E.coli的生长抑制程度较强,从而减弱了其产生组胺的能力。C、F组中pH的这种变化趋势与吕珍等[19]的研究结果相似,随着培养过程的进行,3株菌对应培养基的pH均呈现下降趋势。四组中pH的这种变化趋势与张雅晴等[22]在大蒜精油对屎肠球菌和粪肠球菌产苯乙胺和酪胺的影响的研究结果也相似,在含组氨酸底物的培养液中,由于生物胺的产生,导致pH在对数期后迅速上升并趋于稳定。

图4 阿魏酸对E. coli生长过程中pH的变化Fig.4 The pH change of ferulic acid against E. coli in the process of growth注:C-在VRBG培养基中接种E. coli菌悬液;F-在含有阿魏酸的VRBG培养基中接种E. coli菌悬液;H-在含有组氨酸底物的VRBG培养基中接种E. coli菌悬液;FH-在含有组氨酸底物和阿魏酸的VRBG培养基中接种E. coli菌悬液。

图5 阿魏酸对B. cereus生长过程中pH的变化Fig.5 The pH change of ferulic acid against B. cereus in the process of growth注:C-在MSA培养基中接种B. cereus菌悬液;F-在含有阿魏酸的MSA培养基中接种B. cereus菌悬液;H-在含有组氨酸底物的MSA培养基中接种B. cereus菌悬液;FH-在含有组氨酸底物和阿魏酸的MSA培养基中接种B. cereus菌悬液。

2.5 HPLC测定阿魏酸对待测菌株作用后组胺含量

2.5.1 线性实验 以不同浓度的组胺标准溶液为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：Y=53433X+67201，R2=0.9996。结果表明，组胺线性关系良好，可用外标法进行测定。

2.5.2 精密度实验 按照1.2.5.5实验方法操作，得到组胺对应的峰面积RSD值为0.21%，精密度符合检测要求。

2.5.3 重复性实验 按照1.2.5.6实验方法操作，得到组胺对应的峰面积RSD值为5.36%，该方法的重复性良好，符合要求。

2.5.4 稳定性实验 按照1.2.5.7实验方法操作，得到组胺对应的峰面积RSD值为1.32%，表明供试菌液在24 h内稳定。

2.5.5 回收率试验 按照1.2.5.8实验方法操作，结果表明，组胺平均回收率97.35%，对应的峰面积RSD值为3.41%，可见该方法可满足组胺检测的需要。

2.5.6 样品溶液中组胺的色谱分离图 参照1.2.5.2方法进行HPLC分析。选取其中添加0.000%和添加0.063%阿魏酸后B.cereus溶液中组胺的色谱图来进行对比，记录色谱图6。从图中可以看出溶液中组胺的色谱分离度及峰形均良好，组胺的保留时间为12.24 min，与未添加阿魏酸的B.cereus培养液相比(图6a)，添加0.063%阿魏酸后B.cereus溶液中(图6b)组胺的峰高明显变低，说明阿魏酸对减少B.cereus样品溶液中组胺的含量具有很好的抑制效果。

图6 组胺样品图谱Fig.6 HPLC chromatographic profiles of histamine content注:a-未添加阿魏酸的组胺样品图谱; b-添加0.063%阿魏酸后的组胺样品图谱。

2.5.7 阿魏酸对组胺的抑制作用 由图7可知,添加不同浓度的阿魏酸对减少供试菌中的组胺的含量具有显著性效果(p<0.05),当添加0.13%阿魏酸时,E.coli中组胺的最低生成量能达到88.12 μg/mL,较空白对照组减少了37.94%,B.cereus中组胺的最低生成量达到79.13 μg/mL,相对于空白对照组减少了38.18%。当阿魏酸的添加量在为最低抑菌浓度时,E.coli中组胺的生成量能达到115.87 μg/mL,较空白对照组减少了18.45%,B.cereus中组胺的最低生成量达到95.94 μg/mL,相对于空白对照组减少了25.78%。杨健等[23]从鲣鱼内脏中分离得到两株产组胺蜡状芽孢杆菌,徐赛男[24]从浙东特色腌冬瓜中定向筛选得到的产组胺菌为肠杆菌属中的Enterobacteraerogenes和Enterobacterxiangfangensis,与本实验研究的两株产组胺菌株相似。研究表明,天然植物提取物能够抑制组胺的形成。Luyun Cai[25]研究发现红鱼片的空白组中组胺含量为(19.41±1.63) mg/kg,在添加丁香、孜然和绿薄荷后组胺含量分别降低了(2.66±0.27) mg/kg,(1.84±0.09) mg/kg和(1.27±0.24) mg/kg。杨蓉蓉等[26]研究发现在风干鲈鱼加工及贮藏过程中组胺含量呈上升趋势,随着八角茴香提取物添加量的增加,组胺含量显著(p<0.05)降低。王永丽等[27]就姜辣素对培根加工和成熟阶段的微生物数量变化及生物胺的形成影响作出研究,证实了其在组胺的累积方面具有一定的抑制效果。卢士玲等[28]在发酵剂和植物提取物对传统中式熏马肠中生物胺积累的影响研究中发现植物取物能明显减少(p<0.05)熏马肠中的组胺量。

图7 添加阿魏酸后菌株的产组胺量Fig.7 Changes of histamine contents affected by addition of ferulic acid注:同种微生物不同小写字母表示差异显著(p<0.05)。

3 结论

阿魏酸对两株待测菌液均有抑制作用,抑制率随着阿魏酸浓度的增大而增大。阿魏酸对E.coli和B.cereus的MIC分别为0.031%和0.063%。当阿魏酸的添加量为MIC时,没有影响产组胺菌株的三个生长时期的变化,仅仅减弱了菌株三个生长时期的界限,不添加阿魏酸的培养液中供试菌进入对数生长期后,菌数达到最大值。在含阿魏酸和组氨酸底物的培养液中接种供试菌株pH均呈现对数期前逐渐下降,对数期后逐步上升的趋势。阿魏酸能够影响供试菌生长过程中pH的变化,抑制了供试菌组氨酸脱羧酶的活性,从而减弱了其产生组胺的能力。当阿魏酸的添加量在最低抑菌浓度时,E.coli中组胺的生成量较空白对照组减少了18.45%,B.cereus中组胺的生成量相对于空白对照组减少了25.78%,对供试菌组胺的产生抑制效果显著(p<0.05)。

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