郭 函,迟莹莹,陈诗豪,李 阳,陈巧灵,蒲至恩

(四川农业大学农学院,四川成都 611130)

人们逐渐认识自由基与人体疾病、衰老之间的关系,期望从常用食品中获取更多的抗氧化物质。常见天然具有抗氧化活性物质如茶多酚、类黄酮、植酸、维生素等常作为食品添加剂添加到食品中[1-4],使食品具有较高抑制或清除人体自由基的作用[5],但热加工过程中,生物活性物质会发生氧化、分解、聚合等反应,导致其抗氧化活性发生变化[6-8]。

袁佐云等[9]研究发现经过蒸煮处理粟谷粉的抗氧化能力可以大幅提高;Denis等[10]利用总抗氧化能力法评价煮制对Foion米、小米以及高粱抗氧化活性的影响,结果表明三种谷物的总抗氧化能力均下降;Pradeep等[11]研究发现小米经焙烤后,DPPH·清除能力与还原能力分别增强了5.88%与66.66%。Zhang等[12]将荞麦粉分别进行焙烤、高压蒸汽加热、微波加热,发现其总酚含量无明显变化,总黄酮含量及自由基清除能力明显下降。

近年来的研究结果表明,谷物的抗氧化活性在加工前后出现了明显的变化,是人们对全谷物食品利用时关注的重要方向。目前,外源抗氧化物质对小麦粉不同加工方式下的抗氧化能力的影响鲜有报道。本实验选取5种天然抗氧化剂,在3种面食加工方式下,测定加工前后以及加工过程中DPPH(1,1-二苯基-2-苦基肼自由基)、羟基自由基、超氧阴离子自由基、ABTS[2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐]的清除能力,以寻求更加合理的添加量及加工方式,为人们科学合理加工膳食提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

小麦普通粉 食品级,≥99%,滨州泰裕麦业有限公司;花青素 食品级,≥99%,杭州众芝康菇生物技术有限公司;茶多酚、大豆异黄酮、VC食品级,≥99%,郑州俊鑫诚信食品添加剂有限公司;植酸、VE食品级,≥99%,郑州瑞林食品添加剂有限公司;1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·)、三羟甲基氨基甲烷(Tris Base) 分析纯,≥99%,成都市科龙化工试剂厂;2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS) 分析纯,≥99%,都莱生物科技有限责任公司;乙二胺四乙酸(EDTA)、邻苯三酚、过硫酸钾、碳酸钠、盐酸、没食子酸、水杨酸、丙酮 分析纯,≥99%,成都市科龙化工试剂厂;福林酚 分析纯,≥99%,都莱生物科技有限责任公司;硫酸亚铁 分析纯,≥99%,广东光华科技股份有限公司、过氧化氢 分析纯,≥99%,四川西陇化工有限公司。

78-1磁力加热搅拌器 金坛市医疗仪器厂;HH-8数显恒温水浴锅 江苏金坛市金城国胜实验仪器厂;UV-1800分光光度计 上海美谱达仪器有限公司;JD200-3电子天平 沈阳龙腾电子有限公司;SEF-3Y烤箱 广州三麦机械设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 烘焙处理5种天然抗氧化剂 茶多酚0.30 g/kg、大豆异黄酮6 mg/kg、植酸0.12 g/kg、花青素0.10 g/kg、VC/VE4∶1(0.132 g/kg∶0.033 g/kg)分别添加到100 g面粉中混匀[13],按照国家食品质量标准[14]制作面包(发酵后焙烤熟化，简称发酵+焙烤)、酥性饼干(240 ℃直接焙烤熟化)、馒头(发酵后蒸制熟化，简称发酵+蒸制)。分别在面包烘焙(0、5、10、15、20 min)、饼干烘焙(0、2、4、6、8 min)和馒头蒸制(0、5、10、15、20、25 min)时间点取样,并在面包、饼干、馒头完全熟化的时间点(20、8、25 min)取样。样品置于40 ℃烘箱烘干,磨粉过100目筛,备用。

1.2.2 抗氧化物质提取 分别称取样品2 g,浸泡在20 mL质量分数50%的丙酮溶剂中,避光15 h后过滤回收丙酮提取液[15-16]。丙酮提取液用于后续的抗氧化能力测定。

1.2.3 清除自由基测定

1.2.3.1 清除DPPH自由基法 在样品管中加入2 mL 0.1 mmol/L DPPH的乙醇溶液,再加入2 mL稀释滤液,混合均匀,室温避光反应40 min后,以2 mL稀释的滤液与2 mL溶剂混合物为对照,以2 mL 0.1 mmol/L DPPH乙醇溶液与2 mL溶剂混合物为空白,在517 nm处读取吸光度,样品管相比对照管吸光度值下降的百分比反映其对DPPH自由基清除能力[17]。

其中:Ai:样品的吸光度值;Aj:对照的吸光度值。

1.2.3.2 清除羟基自由基法 在10 mL样品管中,依次加入4 mL稀释的滤液、2 mL 6 mmol/L的FeSO4、2 mL 6 mmol/L水杨酸和2 mL 6 mmol/L H2O2摇匀,室温反应1 min后,以2 mL蒸馏水代替2 mL 6 mmol/L H2O2的混合溶液为对照,以4 mL空白溶剂代替4 mL稀释滤液的混合溶液为空白分别测定510 nm处吸光度值,样品管相比对照管吸光度值下降的百分比反映其对羟基自由基的清除能力[18]。

其中:Ai:样品的吸光度值;Aj:对照的吸光度值。

1.2.3.3 清除超氧阴离子自由基法 取5 mL pH8.3的50 mmol/L Tris-HCl缓冲液、1 mL 10 mmoL/L的EDTA溶液和2 mL蒸馏水混合均匀作为酶底液于25 ℃放置20 min。于10 mL样品管中分别加入8 mL酶底液、1 mL稀释滤液和1 mL邻苯三酚溶液混合均匀,以1 mL 10 mmol/L 的HCL 溶液代替1 mL邻苯三酚溶液为对照,以1 mL 空白溶剂代替1 mL稀释滤液为空白。准确反应3 min止,在320 nm处测定其吸光值。样品管较自氧化实验的吸光度值下降的百分比反映超氧阴离子自由基的清除能力[19]。

超氧阴离子自由基清除率(%)

其中:Ai:样品的吸光度值;Aj:对照的吸光度值。

1.2.3.4 清除ABTS自由基的测定 在试管中加入40 μL的滤液,3 mL的ABTS工业液,准确反应6 min,以溶剂为空白,在734 nm波长下读取吸光度,吸光度值下降的百分比反映其对ABTS自由基清除的能力[20]。

其中:Ai:样品的吸光度值;Aj:对照的吸光度值。

1.2.4 指标权重确定 变异系数法(coefficient of variation method)是一种利用被评价对象指标的变异程度确定指标权重的方法。变异系数通过对数据的标准差与平均值进行求比来获得,变异系数越大的指标,其在评价对象中的分布变异性就越大,在整个评价体系中应该赋予较大的权重;反之则应赋予较小的权重[21-23]。

本实验采用SPSS 20.0进行变异系数法分析,确定4种抗氧化性测定方法的权重,计算所得加权数值作为抗氧化性能综合指标。

抗氧化性能测定方法的变异系数公式如下:

面制品抗氧化性能损失率(%)=(加工后的综合抗氧化评分-加工前的综合抗氧化评分)/加工前的综合抗氧化评分×100

1.3 数据分析

采用SPSS 20.0和Excel 2007进行数据统计分析。

2 结果与分析

2.1 抗氧化剂对不同自由基的清除效果

天然抗氧化剂对不同自由基的清除效果如表1所示,不同抗氧化剂对不同自由基的清除能力不同。大豆异黄酮、茶多酚、花青素对超氧阴离子、羟基自由基的清除能力基本一致,均显著高于DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力,表明黄酮类和酚类物质具有相当强的清除超氧阴离子、羟基自由基能力。在对植酸的抗氧化性测定中,植酸对4种自由基的清除能力有显著差异,其对超氧阴离子自由基的清除能力最高92.37%,对ABTS自由基清除能力最低36.04%。究其原因,体系的pH是影响植酸清除自由基能力的重要影响因子,在一定pH条件下,植酸对不同自由基的清除能力不同[24];在对VC/VE的抗氧化性测定中,VC/VE对4种自由基的清除能力不一致,其对超氧阴离子自由基的清除能力最高97.51%,对羟基的清除能力显著高于对DPPH、ABTS自由基的清除能力。这与葛颖华[25]等人研究维生素C和维生素E结合使用时,具有较强清除超氧阴离子和羟基自由基的能力相符。

表1 抗氧化剂对不同自由基的清除效果Table 1 Scavenging activity of natural antioxidant in different free

2.2 抗氧化剂的氧化性能评价方法

如表2所示,对5种天然抗氧化剂:大豆异黄酮、茶多酚、花青素、植酸、VC/VE分别用不同的抗氧化方法进行测定,使用变异系数法求其权重,计算所得加权数值进行相关性分析,结果如表2所示,每种测定方法对抗氧化性能的测定全部都不相关。自由基测定方法之间的相关性不一致,没有一种抗氧化方法可以完全地评价抗氧化物质的抗氧化能力。本实验通过使用变异系数法求其权重,计算所得加权数值为综合评分,综合评分做为评价面制品的综合抗氧化性能指标。

表2 抗氧化测定方法相关性Table 2 Relevance between each indicator

2.3 不同加工方式对面制品提取液抗氧化性能的影响

2.3.1 面制品直接烘烤的抗氧化能力 饼干烘焙前后体系抗氧化性能变化如表3所示,与对照相比,添加5种天然抗氧化剂能够显著提高体系的抗氧化能力。添加大豆异黄酮的样品在烘焙过程中,抗氧化能力综合评分先逐渐增加后降低,最终烘焙后抗氧化能力综合评分为27.84%,相较于对照的18.52%,抗氧化能力增加了50.32%。原因是高温烘焙时,类黄酮糖苷衍生物分解为对应抗氧化能力更强的配基体,样品细胞壁破坏严重更有利于提取,所以含量呈现先增加趋势[26]。但随着加工时间的增加,由于水溶性黄酮类流失,体系抗氧化活性显著降低,表明热加工时间大豆异黄酮的活性有显著影响。

表3 饼干烘焙前后抗氧化剂性能变化Table 3 Antioxidative activity change trend at the process of baking

添加茶多酚的样品在烘焙过程中,抗氧化能力综合评分持续降低,烘焙前抗氧化能力综合评分为40.02%,烘焙后抗氧化能力综合评分为30.66%,与对照相比提高了65.55%。原因可能是由于非酶褐变反应也会生成一些抗氧化物质,游离态酚类物质的抗氧化活性大于结合态,加热后总酚含量虽然下降,但是游离态酚含量却会上升[27]。

添加花青素的样品在烘焙过程中,综合抗氧化能力持续降低,原因可能是高温烘焙条件下,花青素不稳定发生分解[28]。添加植酸的样品在烘焙前期抗氧化能力综合评分先降低后增高,后持续降低,烘焙后抗氧化能力综合评分为36.84%,显著提高了体系的抗氧化能力。

添加植酸的样品在加工后的抗氧化能力综合评分显著降低后增高，又持续下降;添加VC/VE的样品抗氧化能力综合评分先降低后增加,这主要是因为在热的作用下,同效维生素尼克酸可以从无活性结合态中释放出来,导致烘焙后期抗氧化性能增加[29]。因此烘焙对维生素的影响取决于特定温度下持续的时间。

2.3.2 发酵后蒸制对面制品抗氧化能力的影响 发酵后蒸制(馒头)的加工方式对体系抗氧化性能影响如表4所示,添加5种天然抗氧化剂的样品在蒸制馒头前后综合抗氧化能力均显著降低,与对照相比添加天然抗氧化剂都能够显著提高体系的抗氧化能力。

表4 馒头烘焙前后抗氧化剂性能变化Table 4 Antioxidative activity change trend atthe process of steaming

添加大豆异黄酮的样品在烘焙过程中抗氧化能力综合评分缓慢降低至24.85%;添加茶多酚的样品在烘焙5～10 min时,综合抗氧化评分显著增高,后持续降低,烘焙前后抗氧化能力综合评分损失率为-11.15%;添加花青素的样品抗氧化能力综合评分在烘焙过程中变化趋势不稳定,烘焙25 min后抗氧化能力综合评分为19.63%,损失率为-13.92%;添加植酸的样品烘焙过程中的抗氧化能力综合评分变化趋势为先增高后缓慢降低,烘焙后抗氧化能力综合评分为15.27%,损失率为-4.66%;添加VC/VE的样品在0～15 min的烘焙过程中,抗氧化能力综合评分先降低后增加,烘焙25 min后抗氧化能力综合评分为19.90%,损失率为-5.14%。

蒸制过程中,样品抗氧化活性有大幅度的提高,原因可能是,发酵过程中微生物的代谢活动对样品中生物活性物质进行改性,导致各种生物活性物质的释放或合成[30-31],进而提高了抗氧化活性;另一方面食物的内部有水分,蒸制温度一般不可能超过100 ℃,具有抗氧化能力的物质经过蒸汽处理更容易提取发挥作用[32]。

2.3.3 发酵加烘烤对面制品抗氧化能力的影响 发酵后烘焙(面包)的加工方式对体系的抗氧化性能影响如表5所示,与对照相比,添加天然抗氧化剂能够显著提高体系的抗氧化能力。相同温度的条件下,随着时间增加,添加大豆异黄酮、茶多酚、花青素、植酸、VC/VE的面粉在烘焙面包后综合抗氧化能力均显著降低。添加大豆异黄酮的样品烘焙后抗氧化能力综合评分为29.10%,与对照相比抗氧化能力提高了53.64%;添加茶多酚的样品在烘焙过程中,初期抗氧化能力综合评分小幅度增加后缓慢降低,烘焙后抗氧化能力综合评分为17.49%;添加花青素的样品在烘焙过程中,抗氧化能力综合评分先增加,在加工5 min后降低,抗氧化能力综合评分在烘焙后为43.61%;添加植酸的样品在烘焙过程中,抗氧化能力综合评分缓慢降低,烘焙后抗氧化能力综合评分为34.04%;添加VC/VE的样品,在加工0～10 min过程中抗氧化能力综合评分先降低,10 min后增加,15 min后降低，烘焙后的抗氧化能力综合评分为11.40%。

表5 面包烘焙过程中抗氧化剂性能变化Table 5 Antioxidative activity change trend atthe process of baking

添加茶多酚和花青素的样品在加工5 min时,综合抗氧化性能显著增加,这与样品中的抗氧化活性物质的含量有关,Saulnier等[33]研究发现当热加工过程中温度达到180 ℃以上,细胞膜和细胞壁的通透性会增强,一些可溶性酚类物质被释放,增强抗氧化活性。

在添加VC/VE的样品在初期加工时,随着时间的增加,维生素的活性显著降低,这与维生素本身的热稳定性有关[34];在加工10～15 min,样品的综合抗氧化活性又显著增加,原因可能是烘焙过程中产生了同效维生素,提高了抗氧化性能[25]。

2.4 加工方式对食品抗氧化性能损失率的影响

添加5种抗氧化剂的样品在不同加工方式下抗氧化性能损失率如表6所示。添加大豆异黄酮的样品,直接焙烤后的抗氧化性能损失率显著低于发酵+焙烤和发酵+蒸制,可见发酵对大豆异黄酮抗氧化活性的影响要大于高温焙烤对其的影响。添加花青素的样品在发酵+焙烤后抗氧化性能损失率显著低于直接焙烤和发酵+蒸制方式;添加VC/VE的样品在发酵+蒸制后的抗氧化性能损失率显著低于发酵+焙烤和直接焙烤。

表6 加工方式对食品抗氧化性能影响Table 6 Antioxidative activity of natural antioxidant in processing

食品的加工烹调方式可能会改变食品的物理性质(如结构及形态改变以及水分的渗出)和化学性质(如蛋白质、维生素、芳香物质等热敏性营养素的降解及损失)[35-36],而且热加工对全谷物中抗氧化活性物质的影响与谷物种类、加工条件密切相关,选择适当的热加工条件,可提高全谷物中抗氧化活性物质含量及其利用率。

3 结论

大量的研究结果表明,谷物食品热加工过程中,其所含的蛋白质、糖类等活性物质会发生相互作用或化学反应,如美拉德反应、糊化反应,影响其抗氧化物质的含量及活性。另外,不同热加工的方式及加工时间对食物中抗氧化物质活性有很大的影响,相同的加工条件对于不同的食物种类、抗氧化剂种类的影响也是不同的。这种影响可能是促进抗氧化作用,也可能抑制其作用。在食品制作过程中,没有一种固定的加工方式可以完全保留其抗氧化活性。因此针对添加的不同天然抗氧化剂,应选择合适的加工方式,在一定程度上提高食品的抗氧化活性和食品的营养价值。

添加大豆异黄酮的面制品应用于直接焙烤(饼干)能更好保留其抗氧化性能,甚至使其抗氧化性能有所增长。添加茶多酚的面制品应用于直接焙烤(饼干)优于发酵+蒸制(馒头)和发酵+焙烤(面包)。添加花青素的面制品应用于发酵+焙烤(面包)会更好地保留其抗氧化性。发酵+蒸制(馒头)则可以更好地保留植酸和VC/VE的抗氧化能力。

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