侯文杰,吴旭干,施文正

(1.上海市水产研究所,上海市水产技术推广站,上海 200433; 2.上海海洋大学,水产种质资源发掘与利用教育部重点实验室,上海 201306; 3.上海海洋大学食品学院,上海 201306)

三疣梭子蟹(Portunustrituberculatus),别称梭子蟹、海蟹、海螃蟹、枪蟹,属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、梭子蟹属(Portunus)[1],是一种常见的暖温性大型海蟹,分布于中国、日本和朝鲜等海域[2]。三疣梭子蟹肉肥细嫩、洁白,膏红肥满,更为上品,味道鲜美,营养丰富,不仅含有丰富的蛋白质、维生素A、B1、B2和尼克酸,还含有钙、磷、铁等矿物质[3],不论口感还是营养,均优于一般水产动物,因此为人们所喜食;此外三疣梭子蟹出口国外,也深受国外消费者喜爱,因此市场价格高[4]。

三疣梭子蟹是我国重要的海产经济蟹类,主要来自于池塘养殖和野生捕捞,2016年池塘养殖和捕捞产量分别为12.53万t和54.21万t[5]。随着人民生活水平的提高,对优质三疣梭子蟹的市场需求量越来越大,但是由于野生渔业资源下降和禁捕期延长等原因,三疣梭子蟹捕捞产量不可能大幅度上市,池塘养殖是今后主要的发展方向[6]。已有研究表明,池塘养殖三疣梭子蟹通常存在卵巢发育不良和生殖性能较差等弊端[7],但池塘养殖和野生捕捞三疣梭子蟹雌体在常规营养成分、脂肪酸和氨基酸组成上并无显著差异[8]。通常认为,野生水产品的滋味和口感优于养殖水产品,故野生水产品的价格通常高于养殖水产品。水产品的滋味物质主要包括游离氨基酸、核苷酸、游离糖、有机酸和无机离子[9]。这些滋味物质的组成和含量直接影响其滋味和品质,其中核苷酸和游离氨基酸对其滋味贡献相对较大[10],迄今为止,尚未见池塘养殖和野生捕捞三疣梭子蟹滋味品质的比较研究。肌肉、卵巢和肝胰腺是三疣梭子蟹雌体最主要的食用部位,其营养品质决定着三疣梭子蟹的营养品质[6]。

鉴于此,本论文首先测定和比较了池塘养殖与野生三疣梭子蟹雌体肌肉、卵巢和肝胰腺中的游离氨基酸和游离核甘酸组成、滋味活度值和味精当量,进一步采用电子舌比较两者的滋味轮廓,以期为三疣梭子蟹的风味评价和养殖梭子蟹的品质调控提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验用池塘养殖三疣梭子蟹雌体 于2016年12月底取于上海市水产研究所启东科研基地的养殖池塘,两个室外池塘的规格为82.5 m×45 m×1.5 m,养殖期间主要饲喂糠虾、小鱼和小麦粉等,养殖时间为6～12月;野生三疣梭子蟹雌体 捕捞于浙江省舟山海域(30°65′ N,122°75′ E),活体运输(采用塑料水族箱,配上小型增氧机,汽车运输)到上海海洋大学营养繁殖实验室用于后续实验；色谱级九种核苷酸标品、色谱级17种氨基酸混标 购于美国Sigma Aldrich公司;5%、10%高氯酸、5%三氯乙酸;磷酸二氢钾、磷酸氢二钾 均购于上海安谱科学仪器公司,分析纯。

ASTREE电子舌 法国Alpha M.O.S 公司;LC-2010CHT型高效液相色谱仪 日本岛津公司;L-8800型氨基酸自动分析仪 日本Hitachi公司;Inertsil ODS-3液相柱(4.6 mm×250 mm,5 μm) GL Sciences公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备 从池塘养殖和野生的三疣梭子蟹雌体中分别挑选规格接近、卵巢发育较好、肢体完整的雌体各10只用于实验,野生和养殖雌体的体重分别为(184±33) g和(199±24) g;在室温20 ℃下活体打开梭子蟹甲壳,分离出卵巢、肝胰腺,剪开头胸甲底部的内骨骼和各附肢,刮出肌肉,放入真空袋中于-20 ℃冰柜中保存备用。

1.2.2 呈味核苷酸的测定 参考CHEN Dewei[11]等的方法稍有修改,准确称取(1±0.001) g卵巢和肝胰腺和(2.5±0.001)g肌肉样品,加入2 mL 10%高氯酸(PCA),高速匀浆30 s后超声处理5 min,10000 r/min,4 ℃离心15 min,取上清液,沉淀用1 mL 5%的高氯酸漂洗,再次离心,重复操作两次,合并上清液。用6 mol/L的KOH溶液调节pH至5.75,静置30 min,取上清液定容至10 mL,摇匀,取适量溶液过0.22 μm 的滤膜后待测,整个过程均在0～4 ℃下操作完成。

高效液相色谱条件:Inertsil ODS-3液相柱(4.6 mm×250 mm,5 μm),柱温30 ℃,流动相流速:1 mL/min,进样量10 μL;紫外检测器检测波长为245 nm。流动相A为甲醇,B为磷酸缓冲液(1.7011 g磷酸二氢钾与2.1733 g磷酸氢二钾定容至1 L,用5%高氯酸调节磷酸盐缓冲液的pH至5.75),并抽滤和超声25 kHZ,5 min。流动相的配比为100%的B保持8 min,2 min线性变化至A为3%,5 min线性变化至A为6%,8 min线性变化至A为30%并保持3 min,100%的B保持4 min。

1.2.3 游离氨基酸的测定 将冷冻样品于4 ℃下解冻,准确称取蟹肉0.5 g,卵巢肝胰腺1 g左右,精确到0.0001 g,加入5%三氯乙酸TCA溶液15 mL,高速均质30 s,28 kHz超声处理15 min后于4 ℃冰箱静置2 h,冷冻离心(10000 r/min,4 ℃,10 min),取5 mL上层清液,将pH调至2.0后定容至10 mL容量瓶中,取适量溶液过0.22 μm的滤膜后待测[12-13]。

1.2.4 滋味活度值 滋味活度值(taste active value,TAV)为样品中呈味物质浓度的测定值与呈味物质的味道阈值的比值,TAV≥1时,该呈味物质对于样品的整体滋味有显著影响,数值越大贡献越大;TAV<1时,该呈味物质对整体滋味贡献不明显[14]。

1.2.5 味精当量 味精当量(Equivalent Umami Concentration,EUC)表达式中呈味核苷酸包括5′-IMP,5′-GMP,5′-AMP,鲜味氨基酸除了谷氨酸外还包括天冬氨酸。用方程式表示为:

EUC=Σaibi+1218(Σaibi)(Σajbj)

其中:EUC为味精当量(g MSG/100 g);ai是鲜味氨基酸(Glu 或 Asp)的浓度(g/100 g);bi是鲜味氨基酸相对于 MSG 的鲜度系数(Glu:1,Asp:0.077);aj是呈味核苷酸(5′-IMP,5′-GMP,5′-AMP)的浓度(g/100 g);bj是呈味核苷酸相对于 IMP 的鲜度系数(5′-IMP:1;5′-GMP:2.3;5′-AMP:0.18)[15]。

1.2.6 电子舌检测 参考王慧[16]的方法,在参数上做微调。准确称取待测蟹样(肌肉、卵巢、肝胰腺)2 g于50 mL离心管中,误差不超过0.01 g,加入25 mL娃哈哈纯净水,均质机均质30 s后超声(28 kHz;5 min),静置30 min,在4 ℃下以10000 r/min离心15 min;过滤,取下层沉淀,再加入25 mL娃哈哈纯净水,静置10 min,在4 ℃、10000 r/min的条件下离心15 min,合并两次滤液并定容到100 mL。

在电子舌专用的进样杯中加入5 mL滤液,加入去离子水到80 mL刻度,保证室内物理条件不发生变化的情况下室温完成测定。将每个样品的数据采集时间设置为120 s,以1 s为周期完成数据采集,选取第120 s出现的响应值作为电子舌原始数据信号,以10 s为周期完成清洗。每个样品做7次平行以增加结果的可靠性,取每组样品后3次的原始数据做主成分分析(principal component analysis,PCA)。

1.3 数据处理

数据结果以平均值±标准偏差(mean±SD,n=3)表示,采用SPSS 20.0对数据进行方差分析和多重比较;电子舌主成分分析由工作电脑自带的Alpha Soft 14.0进行分析。

2 结果与分析

2.1 呈味核苷酸分析

ATP及其降解产物是水产品中核苷酸及其关联化合物的重要组成部分,是水产品鲜味产生的重要因素之一,其含量的变化是一个相对复杂的动态过程,一般认为,鱼类死后ATP在其体内的降解途径为:ATP→ADP→AMP→IMP→HxR→Hx,降解过程中分别受到ATP酶、ADP酶、AMP脱氢酶、磷酸脂酶和核苷酶等多种酶的影响和控制[17-18]。其中对水产品风味有主要贡献的是IMP和AMP,IMP降解生成HxR的速度较慢,因此IMP通常会在新鲜的水产品中得到积累,是其的一种主要呈味核苷酸类物质,是鲜味极强的风味增强剂,与谷氨酸共存时有着显著的风味协同作用[19-20];AMP有抑制苦味的特性,能使食品产生理想的咸味与甜味,而且和IMP结合能提高鲜味强度[17]。

表1和表2分别为池塘养殖和野生养殖三疣梭子蟹肝胰腺、卵巢、肌肉三个可食部位的呈味核苷酸GMP、IMP、AMP含量及滋味活度值。由表1可看出,在三疣梭子蟹三个可食部分中,池塘养殖和野生养殖三友梭子蟹的肝胰腺和肌肉中的GMP、IMP和AMP的含量无显著性差异(p>0.05),卵巢中的GMP、IMP、AMP的含量差异显著(p<0.05)。就不同部位而言，肌肉中AMP的含量显著(p<0.05)高于肝胰腺中的含量,分别为97.60、91.58 mg/100 g和14.79、19.96 mg/100 g。从滋味活度值方面，肝胰腺中的GMP、IMP、AMP和肌肉中的AMP的滋味活度值(TAV)均小于1,说明它们对肝胰腺和肌肉的整体滋味没有显著影响,而池塘养殖与野生三疣梭子蟹肌肉中的GMP的滋味强度值分别为3.90和3.66,这表明GMP对三疣梭子蟹的肌肉整体滋味具有贡献。其次,池塘养殖与野生梭子蟹肝胰腺和肌肉中的IMP具有一定的差异,但是差异不显著(p>0.05),其中肝胰腺中IMP滋味活度值小于0.5,肌肉中IMP滋味活度值大于1。由此表明呈味核苷酸在不同部位中的含量和滋味贡献度不同,且相比于肝胰腺部分,三疣梭子蟹的肌肉更为鲜美,对于三疣梭子蟹不同部位进行分类加工研究具有一定指导作用。

表1 池塘养殖与野生捕捞梭子蟹呈味核苷酸的含量Table 1 The content of taste nucleotides in Portunus trituberculatus cultured in pond and wild-caught

表2 池塘养殖与野生梭子蟹可食部位呈味核苷酸滋味活度(TAV)值Table 2 TAVs of taste nucleotides in Portunus trituberculatus cultured in pond and wild-caught

池塘与野生组卵巢的三种核苷酸含量均差异显著(p<0.05),其中IMP含量差异最大,池塘养殖为303.46 mg/100 g,是野生养殖的6.7倍,其对应的滋味活度值分别为12.14和1.80,均大于1,说明IMP对卵巢的滋味贡献值高,且对池塘养殖组的滋味贡献度远大于野生组。AMP含量最高,池塘和野生组分别为313.41和221.35 mg/100 g,分别占其呈味核苷酸总量的40.00%和60.23%;滋味活度值高达13.48和8.08,GMP含量则为168.52和101.02 mg/100 g,池塘养殖组含量显著高于野生组(p<0.05)。结合图1可直观看出三疣梭子蟹三个可食部分中卵巢所含呈味核苷酸总量最多,其次是肌肉和肝胰腺,与王慧[14]的不同温度养殖三疣梭子蟹的风味研究结论相同。此外,池塘养殖三疣梭子蟹卵巢呈味核苷酸总量明显高于野生三疣梭子蟹,分别为785.38、367.46 mg/100 g,池塘、野生组的肌肉与肝胰腺则分别是32.86、35.51 mg/100 g和130.53、146.95 mg/100 g,含量相当,说明池塘养殖三疣梭子蟹整体滋味鲜于野生三疣梭子蟹。另一方面,卵巢品质是三疣梭子蟹育肥的重要标准之一[6],池塘养殖可以大幅度提供卵巢品质,从而提高三疣梭子蟹的经济价值。

研究选取的样本多为卵巢发育较为成熟的个体,除卵巢外,含量最高的核苷酸均为AMP,由于AMP的甜味滋味轮廓表现出来是独立的,使蟹肉变得香甜可口。蟹肉的呈味过程存在协同效应且受多种因素影响,凭游离核苷酸含量和其对应的滋味活度值尚不能对比池塘养殖和野生捕捞三疣梭子蟹的滋味,需结合游离氨基酸、味精当量、电子舌主成分分析等对两种不同来源的螃蟹进行综合比较。

2.2 游离氨基酸分析

三疣梭子蟹富含丰富的蛋白质和游离氨基酸,大部分蛋白质本身是无味的,经过水解得到肽和氨基酸,游离氨基酸(free amino acid,FAA)又称为非蛋白氨基酸,是一种重要的风味物质,呈酸、甜、苦、鲜等滋味,其滋味由分子结构中的亲水基和疏水基决定,大部分亲水基有宜人的滋味,而疏水基常有不宜人的滋味[21]。游离氨基酸对滋味的影响是一个复杂的过程,与其种类、含量以及自身阈值都有关联,不同种类的氨基酸、氨基酸与肌苷酸之间还存在相互协同作用共同影响食物滋味。三疣梭子蟹肉的鲜美程度除受核苷酸影响外,还取决于肌肉中呈味氨基酸的阈值和含量,表3为池塘养殖与野生三疣梭子蟹可食部位检测到的17种氨基酸阈值、滋味特征[14,20]和含量。

表3 池塘养殖与野生捕捞梭子蟹可食部位游离氨基酸含量Table 3 The content of free amino acid in Portunus trituberculatus cultured in pond and wild-caught

由表3可知,池塘养殖组卵巢中呈味氨基酸和必需氨基酸占总游离氨基酸的百分比为29.86%和28.32%,野生组分别为36.30%和23.93%。在池塘和野生三疣梭子蟹卵巢中含量最高的三种氨基酸均为精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)和赖氨酸(Lys),三者之和分别占到了其组中总游离氨基酸总量的61.49%和72.24%其中赖氨酸是必需氨基酸,脯氨酸属于呈味氨基酸。除此之外,含量较高的氨基酸还有甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)和苏氨酸(Thr),其中苏氨酸属于必需氨基酸,甘氨酸和丙氨酸为呈味氨基酸。甘氨酸和丙氨酸为三疣梭子蟹卵巢提供了甜味,其中甘氨酸还有去咸和去苦的作用,丙氨酸甜中略带苦味。含量稍低的谷氨酸(Glu)的化合物谷氨酸钠是鲜味的重要呈味物质,在一定条件下与IMP的协同作用增强三疣梭子蟹的鲜味。精氨酸(His)呈苦味,在某些水产品中表现出“肉香”的味觉特征[21]。由表4可知,池塘和野生三疣梭子蟹卵巢中TAV≥1的氨基酸为谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、组氨酸、精氨酸其中野生组精氨酸的TAV最高,为14.08。综上所述,三疣梭子蟹的卵巢主要表现出的滋味有鲜、甜、苦。

表4 池塘养殖与野生捕捞梭子蟹可食部位氨基酸滋味活度值Table 4 TAVs of amino acid taste nucleotides in Portunus trituberculatus cultured in pond and wild-caught

池塘养殖三疣梭子蟹与野生三疣梭子蟹肝胰腺氨基酸含量差别较明显,其中谷氨酸、半胱氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸六种游离氨基酸含量差异显著(p<0.05),且均为野生三疣梭子蟹含量高于池塘养殖;野生三疣梭子蟹呈味氨基酸和必需氨基酸所占百分比为51.77%、28.48%,均低于池塘养殖三疣梭子蟹相应百分含量53.30%和34.83%;野生三疣梭子蟹肝胰腺中组氨酸、精氨酸的TAV值分别达到4.12、10.42,远远大于1,表明它们对野生三疣梭子蟹滋味贡献较大,其主要呈现滋味为苦味,一定程度上说明野生三疣梭子蟹略苦于池塘养殖三疣梭子蟹。其次,肝胰腺的滋味活度值除酪氨酸(Tyr)和半胱氨酸(Cys)由于其阈值未找到没有计算出以外其余氨基酸中有多种的TAV均达到1以上,对样品滋味贡献明显。甲硫氨酸(Met)的TAV值在池塘养殖组和野生组中分别达到了4.39和4.68,除甜味和苦味之外还有硫味。与池塘养殖三疣梭子蟹相比,野生三疣梭子蟹的肝胰腺富含更多的氨基酸,但差异不明显。由于肝胰腺是人们常说的“蟹黄”的组成之一,因此对它的呈味物质研究也颇有意义,而氨基酸又是重要的营养物质,先前有关三疣梭子蟹营养研究主要侧重于肌肉和卵巢部分,有关肝胰腺部分的研究较少,这也是本次研究的意义之一。

在池塘养殖和野生捕捞的三疣梭子蟹肌肉,半胱氨酸和丝氨酸都未检测出,其中呈味氨基酸分别占总氨基酸的60.10%和60.54%,远高于必需氨基酸比例。含量较高的几种氨基酸分别是甘氨酸、脯氨酸和精氨酸,含量加和分别占总含量百分比的70.41%和70.78%,这个比例差异在池塘养殖组和野生组中并不明显。在呈味氨基酸中,野生组的甘氨酸含量达到了978.99 mg/100 g,与池塘养殖组的783.97 mg/100 g相比有明显增加,其TAV值也达到了7.53,高于池塘养殖组的6.03,此差异在丙氨酸中表现更为明显,野生组丙氨酸更是达到7.96。与池塘养殖组相比,野生三疣梭子蟹除天冬氨酸、酪氨酸、组氨酸和精氨酸外其余检测到的氨基酸含量均高于池塘养殖组,此差异也表现于滋味活度值上。两个组别中除各自未检测出和未找到阈值的氨基酸外,其余氨基酸的滋味活度值也大多数在1以上。除精氨酸TAV远大于其余氨基酸外,滋味活度值较大的氨基酸还有甘氨酸和丙氨酸,它们主要为三疣梭子蟹肌肉的甜味作出贡献;主要呈鲜味的谷氨酸含量和滋味活度值相对较低。

2.3 呈味核苷酸与氨基酸的协同效应

鲜味作用可在鲜味氨基酸和呈味5′-核苷酸的相互作用下得到显著增强[23],这种相互作用称之为氨基酸与核苷酸协同效应,并用EUC(Equivalent Umami Concentration)味精当量来表示鲜味的强烈程度。

图1是池塘养殖和野生三疣梭子蟹EUC味精当量及TAV值,由图1可看出,三疣梭子蟹卵巢的EUC值远大于肝胰腺和肌肉的EUC值,其中池塘养殖卵巢EUC值为53.94 g MSG/100 g,野生三疣梭子蟹卵巢EUC值是15.81 g MSG/100 g,味精当量TAV值分别是1797.95和526.84,说明鲜味强烈,且池塘养殖三疣梭子蟹卵巢的鲜味明显优于野生三疣梭子蟹。而肝胰腺中池塘养殖组和野生组三疣梭子蟹的EUC值分别是6.57、8.447 g MSG/100 g,不足池塘养殖卵巢中的五分之一,肌肉中的含量则更少,说明三疣梭子蟹的卵巢鲜味显著优于肝胰腺和肌肉部分。石婧[26]的研究中指出,在中华绒螯蟹中,雌体卵巢的EUC含量远大于肌肉中的含量,王慧在研究水温对三疣梭子蟹风味的影响中也指出卵巢的EUC值远高于肌肉[14]。

图1 池塘养殖和野生三疣梭子蟹味精当量及TAV值Fig.1 Comparison of EUC and TAV in Portunus trituberculatus cultured in pond and wild-caught

2.4 电子舌分析

在生物味觉体系中,舌头味蕾细胞的生物膜非特异性的结合食物中的味觉物质,产生的生物信号转化为电信号并通过神经传输至大脑,经分析后获得味觉信息[24]。主成分分析(PCA)是对传感器响应的特征向量矩阵进行数据转换和降维,并做线性分类,损失很少信息的前提下将多个指标转变为少数重要综合指标,最后结果以二维散点图形式显示[25]。图2为池塘养殖和野生三疣梭子蟹可食部分(卵巢、肝胰腺、肌肉)电子舌PCA分析图,可以得知第一主成分和第二主成分的贡献率分别80.138%和9.992%,两者之和达到90%以上,涵盖了原始数据90%以上的信息,其结果具有较好的代表性。从图2可以看出,三疣梭子蟹的不同可食部位之间大部分可以区分,说明两种养殖模式下三疣梭子蟹的不同可食部位之间的水溶性成分含量有明显差异。两种模式的卵巢和肌肉组相距较远,轮廓可有效区分,说明池塘养殖组和养殖组三疣梭子蟹的卵巢、肌肉中水溶性成分差异显著,电子舌可以明显区分;肝胰腺组轮廓重叠,说明电子舌不能有效区分两种模式间的肝胰腺。因此可以认为两种模式对三疣梭子蟹卵巢和肌肉的滋味影响较大,电子舌可以明显区分;对肝胰腺滋味影响较小,电子舌不能有效区分。

图2 池塘养殖和野生三疣梭子卵巢、肝胰腺、肌肉电子舌PCAFig.2 PCA analysis of ovary,hepatopancreas and muscle in Portunus trituberculatus cultured in pond and wild-caug注:a.野生组卵巢；b.池塘养殖组卵巢；c.野生组肝胰腺；d.池塘养殖组肝胰腺；e.野生组肌肉；f.池塘养殖组肌肉。

3 结论

池塘养殖和野生三疣梭子蟹肝胰腺和肌肉中三种呈味核苷酸含量没有显著差异,而卵巢中三种核苷酸含量差异显著(p<0.05),主要表现在池塘养殖三疣梭子蟹的含量显著高于野生养殖,IMP、GMP、AMP分别是野生三疣梭子蟹的6.7、1.7、1.4倍。池塘养殖和野生三疣梭子蟹肝胰腺中游离氨基酸含量差异较卵巢、肌肉更大,池塘养殖三疣梭子蟹肝胰腺中的呈味氨基酸与必需氨基酸占比均高于野生三疣梭子蟹,野生三疣梭子蟹中的苦味氨基酸对整体滋味贡献度较大,池塘养殖三疣梭子蟹中的苦/甜味氨基酸对整体滋味贡献度较大。池塘养殖卵巢EUC值为53.94 g MSG/100 g,野生三疣梭子蟹卵巢EUC值是15.81 g MSG/100 g,池塘养殖三疣梭子蟹卵巢明显鲜于野生三疣梭子蟹,三疣梭子蟹的卵巢鲜味显著优于肝胰腺和肌肉部分。电子舌主成分分析显示池塘养殖与野生三疣梭子蟹的肝胰腺滋味轮廓没有明显区别,但是卵巢与肌肉的整体滋味轮廓无重叠部分,且主要差异都体现在第一主成分轴上,说明两种模式对三疣梭子蟹的卵巢和肌肉滋味有影响。研究结果表明池塘养殖的三疣梭子蟹卵巢整体滋味优于野生三疣梭子蟹,肌肉和肝胰腺的差异不明显,说明池塘养殖可以提升三疣梭子蟹的滋味并能实现一定程度的育肥。

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